特異性抗體IMab-1在人腦膠質(zhì)瘤IDH1基因突變檢測(cè)中的臨床價(jià)值

李航 于佳龍 羅勇 蔣其俊 楊開(kāi)華

(遵義市第一人民醫(yī)院(遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)神經(jīng)外科，貴州 遵義 563000)

腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤之一，占原發(fā)性腦部腫瘤的60%以上〔1〕。腦膠質(zhì)瘤患者的病死率和殘疾率極高。根據(jù)惡性程度，世界衛(wèi)生組織(WHO)通常將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ 4個(gè)級(jí)別。Ⅰ和Ⅱ型通常被劃分為低級(jí)別膠質(zhì)瘤，Ⅲ和Ⅳ型則被劃分為高級(jí)別膠質(zhì)瘤〔2〕。長(zhǎng)期以來(lái)，針對(duì)腦膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制的研究有限，相應(yīng)的治療手段有限，療效有限，如臨床常用替莫唑胺等藥物治療等，因此，尋找新臨床診療措施的意義重大。近年來(lái)，隨基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的迅速發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了許多膠質(zhì)瘤的分子標(biāo)記，特別是異檸檬酸脫氫酶同工酶(IDH)突變與原發(fā)性膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔3，4〕。

有報(bào)道在2008年指出，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤外顯子序列中發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤與IDH1突變有關(guān)，并且IDH1基因132位的精氨酸(R)被發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為組氨酸(H)〔5〕。后續(xù)研究表明，IDH1 R132H突變是膠質(zhì)瘤中最常見(jiàn)的突變〔6〕，且80%～90%的Ⅰ和Ⅱ型膠質(zhì)瘤存在IDH突變〔7〕。多項(xiàng)研究表明，繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中多見(jiàn)IDH1 突變，且其陽(yáng)性率出現(xiàn)發(fā)病年齡降低的趨勢(shì)，同時(shí)，IDH1 突變?cè)趶浡孕切渭?xì)胞瘤與少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤也被發(fā)現(xiàn)，且專(zhuān)屬性較強(qiáng)〔8～10〕。本研究采用IMab-1作為IDH1 R132H 的特異性抗體，聯(lián)合免疫組化及Western印跡檢測(cè)方法，測(cè)定人腦膠質(zhì)瘤中IDH1 基因突變發(fā)生情況，探討檢測(cè)方法的可靠性及在腦膠質(zhì)瘤檢測(cè)中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取2012年1月至2019年1月遵義市第一人民醫(yī)院、遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院及貴州航天醫(yī)院的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本107例。其中，男60例，女47例，年齡37～85歲，平均(60.5±4.2)歲。病理分型依據(jù)2007年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤新分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，包括Ⅰ級(jí)8例、Ⅱ級(jí)48例、Ⅲ級(jí)28例、Ⅳ級(jí)23例。另取其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)腫瘤標(biāo)本18例，包括腦膜瘤8例，垂體瘤6例，中樞神經(jīng)系統(tǒng)淋巴瘤4例。取腦外科手術(shù)治療的內(nèi)減壓正常腦組織20例為對(duì)照。

1.2試劑與儀器 鼠抗人IDH1抗體購(gòu)自德國(guó)Dianova公司；羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invent Biotechnologies公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒由上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；人IDH 基因組序列來(lái)自GenBank，引物由上海美吉生物技術(shù)有限公司提供；RNA提取試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒由美國(guó)ABI公司提供；PCR儀由美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)；Triolz和熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；美國(guó)ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行基因片段測(cè)序；96孔純化板購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.3免疫組化 SP法進(jìn)行免疫組化：切片常規(guī)脫蠟，3%過(guò)氧化氫(80%甲醇)阻斷過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉，行微波爐抗原修復(fù)后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2～3次，甩去多余液體；滴加Ⅰ抗(鼠抗人IDH1抗體，DIANOVA，Clone H09)，4℃過(guò)夜，37℃復(fù)溫45 min。PBS洗3次各5 min；滴加Ⅱ抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗)，37℃，1 h，鏈酶親和素-過(guò)氧化物酶溶液10 min，PBS或自來(lái)水沖洗10 min；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色2 min，中性樹(shù)膠封片，晾干，顯微鏡下觀察。

1.4Western印跡 將適量的膠質(zhì)瘤(約400 mg)置于-80℃冰箱中保存，放入標(biāo)記管中，用4℃PBS洗滌5 min(4次)。清洗后，用剪刀剪開(kāi)肺組織，加入裂解液，再加入苯甲基磺酰氟(PMSF)到裂解液中。裂解液與PMSF的比例為100∶1，用攪拌棒充分研磨10 min，將裂解后的樣品置于高速冷凍臺(tái)式離心機(jī)中，以13 000 r/min離心5 min，除去上清液，丟棄剩余顆粒，樣品保存在-80℃冰箱中進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。冰上勻漿，使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取組織總蛋白，使用細(xì)胞質(zhì)和核提取試劑盒(USA)提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。每孔加入50 μg蛋白，10%～12% SDS-PAGE分離，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗鼠抗人IDH1抗體，4℃過(guò)夜，次日室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗2 h。電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，曝光、顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，Image J軟件對(duì)相應(yīng)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.5結(jié)果判斷 (1)免疫組化染色陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞胞質(zhì)中有棕黃色或棕色顆粒；閱讀過(guò)程由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家同時(shí)進(jìn)行盲法評(píng)估，以雙半定量法進(jìn)行評(píng)分。操作詳細(xì)步驟：顯微鏡下隨機(jī)定位高倍視野觀察點(diǎn)8個(gè)，同時(shí)手工記錄鏡下的高倍視野中顯示4個(gè)陽(yáng)性染色結(jié)果的百分率。突變陽(yáng)性率10%以上的IDH1突變?yōu)殛?yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。(2) Western印跡陽(yáng)性檢測(cè)：經(jīng)PVDF膜顯示結(jié)果，若52 kD附近顯示陽(yáng)性條帶，則可將結(jié)果判斷為IDH1突變陽(yáng)性。

1.6基因片段測(cè)序 基因組經(jīng)提取DNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增與純化：引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè)計(jì)目標(biāo)引物。參考模板為人IDH基因組序列(GenBank登錄號(hào)：NM 005896)，引物由上海美吉生物技術(shù)有限公司合成。引物序列：IDH正義鏈：5′-CAAGCCGAGAATGCTGAGTTCAT-G-3′，反義鏈：5′-GCAA-GGGATGATTTCCTGCCAG-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括10×ExTaq緩沖液(3 μl)，IDH-正義鏈(3 mmol/L)溶液(2.5 μl)，IDH-反義鏈(3 mmol/L)溶液(2.5 μl)，純凈水(18.8 μl)，DNA(1 μl)，脫氧核糖核苷酸(dNTP)溶液(2.5 mmol/L,0.5 μl)，Ex Taq溶液(0.2 μl)，混合齊全后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)完成后，按照Millipore 公司96純化板操作流程操作，經(jīng)轉(zhuǎn)板操作后，使用ABI3730型測(cè)序分析儀進(jìn)行測(cè)序。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism6軟件進(jìn)行χ2或Fisher精確概率檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同病理類(lèi)型腫瘤染色 不同病理類(lèi)型腫瘤(IDH1基因突變)的胞質(zhì)呈棕褐色或棕黃色，強(qiáng)度不同。見(jiàn)圖1。

A.IDH1 突變陰性彌漫性星形細(xì)胞瘤;B.IDH1突變陽(yáng)性繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;C.IDH1突變陽(yáng)性原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;D.IDH1突變陽(yáng)性彌漫性星形細(xì)胞瘤圖1 不同病理類(lèi)型腫瘤(免疫組化染色，×400)

2.2Western印跡 IDH1 R132H突變陽(yáng)性蛋白在52 kD附近顯示明顯的電泳條帶，而野生型(WT)IDH1 R132H蛋白未見(jiàn)陽(yáng)性條帶，見(jiàn)圖2。

1～4：彌漫性星形細(xì)胞瘤,間變性星形細(xì)胞瘤,少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤，間變性少枝膠質(zhì)瘤；132H：IDH1 R132H 突變型圖2 Western印跡檢測(cè)結(jié)果

2.3基因測(cè)序結(jié)果 WT IDH1 基因在R132 位點(diǎn)顯示CGT正常單峰形態(tài)；IDH1 R132H基因突變主要為雜合性點(diǎn)突變，該基因132 位點(diǎn)因?yàn)楹塑账嵬蛔?CGT→CAT)，蛋白表達(dá)由組氨酸取代原編排的精氨酸位點(diǎn)，而CAT 序列中的A 位置顯示典型的雙峰形態(tài)。

2.4IDH1突變3種檢測(cè)方法比較 IDH1 基因陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果：基因片段測(cè)序方法(A組)為54例，免疫組化法(B組)為45例，Western印跡(C組)為49 例，3組結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3種檢測(cè)方法IDH1突變比較(n)

3 討 論

IDH催化異檸檬酸產(chǎn)生α-酮戊二酸(KG)。當(dāng)IDH1基因突變時(shí)，其相應(yīng)的功能和產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化。它通過(guò)產(chǎn)生高水平的2-羥基戊二酸(Hg)，使機(jī)體的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)水平上調(diào)，加速形成腫瘤微環(huán)境，另外，體內(nèi)的低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α水平也因此增長(zhǎng)迅速，加速膠質(zhì)瘤對(duì)正常組織的侵襲，從而抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的分化。導(dǎo)致膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展〔11～13〕。研究表明，星形細(xì)胞瘤或膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的IDH1基因突變較為頻繁，室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤等其他膠質(zhì)瘤中IDH1基因突變較為少見(jiàn)〔14〕。本文選取的不同病理類(lèi)型的腦膠質(zhì)瘤中，毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤室管膜瘤、間變室管膜瘤、髓母細(xì)胞瘤均未檢出IDH1基因突變。其中，IDH1基因突變位點(diǎn)基本位于異檸檬酸鹽的結(jié)合部位的進(jìn)化保守區(qū)域132 位點(diǎn)，突變類(lèi)型大多部分為雜合型〔15〕。

基因突變的檢測(cè)方法較多，包括基因測(cè)序、免疫組織化學(xué)及Western印跡等?；驕y(cè)序在現(xiàn)階段的應(yīng)用較廣，該檢測(cè)方法也是 IDH1 基因突變的最常用手段〔16〕。特別是臨床診療方面，由于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的提出，個(gè)體化治療顯得尤為重要?；驕y(cè)序作為臨檢常用手段，伴隨腫瘤治療的全生命周期。臨床對(duì)腫瘤的檢測(cè)結(jié)果的可信度基本來(lái)源于對(duì)腫瘤DNA的序列分析。近年來(lái)，隨人工智能及生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，臨床快速測(cè)序技術(shù)已經(jīng)達(dá)到一個(gè)新的高度，患者接受該技術(shù)檢測(cè)的費(fèi)用及時(shí)間均顯著減少〔17〕。唯一的不足為該技術(shù)檢測(cè)的準(zhǔn)確性基于樣本的高度純凈性，若腫瘤周?chē)ＤX組織的DNA 受到污染或淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較多，其中的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤和內(nèi)皮細(xì)胞即可稀釋IDH1基因突變相關(guān)DNA信息，造成DNA信號(hào)低于檢測(cè)限，產(chǎn)生假陰性結(jié)果，相反，目標(biāo)信號(hào)的降低，相對(duì)抬高了背景信號(hào)的水平，也可能使原本陰性的結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榧訇?yáng)性。研究表明，準(zhǔn)確可信的測(cè)序檢測(cè)結(jié)果主要基于至少需要20%以上突變的等位基因〔18〕。隨分子生物學(xué)的快速發(fā)展，測(cè)序所需的特異性抗體也日新月異，穩(wěn)定性IDH1 R132H 特異性抗體IMab-1的出現(xiàn)使IDH1基因突變的檢測(cè)在常規(guī)病理實(shí)驗(yàn)室也能實(shí)現(xiàn)〔19〕。

另外，作為特異性的IDH1 R132H 抗體，IMab-1不與WT IDH1 基因及其他類(lèi)型基因反應(yīng)。經(jīng)ELISA后，如果細(xì)胞胞質(zhì)被染色呈棕褐色或棕黃色則表明IMab-1 染色陽(yáng)性。常規(guī)情況下，IDH1 基因突變特異性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，因此其他體細(xì)胞經(jīng)ELISA后不會(huì)被染色。

有報(bào)道顯示，IDH1基因突變表達(dá)在毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤中未見(jiàn)，而在彌漫性星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，兩者的組織病理診斷較為混淆，利用IMab-1可有效鑒別兩者病理類(lèi)型〔13〕；同時(shí)，臨床發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤患者若見(jiàn)IDH1突變陽(yáng)性，則其預(yù)后優(yōu)于IDH1突變陰性患者，因此，如果早期選擇了特異性抗體IMab-1進(jìn)行IDH1基因突變檢測(cè)，可有效評(píng)估相關(guān)疾病的預(yù)后〔20〕。另外，本研究發(fā)現(xiàn)IMab-1染色強(qiáng)度與腫瘤病理分級(jí)無(wú)關(guān)，其原因可能為IDH1基因突變主要見(jiàn)于腫瘤發(fā)生的早期階段，且不會(huì)隨腫瘤的進(jìn)展而出現(xiàn)明顯增強(qiáng)現(xiàn)象；其次可能由于樣本的不純凈性，本研究選取的膠質(zhì)瘤樣本中夾雜其他細(xì)胞，包括壞死組織、血液細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等，IDH1基因突變?cè)谶@些組織中的表達(dá)均為陰性，最后可能與本研究的檢測(cè)手段相關(guān)，試驗(yàn)中常用的檢測(cè)手段的檢測(cè)結(jié)果均存在假陰性率可能性，其差異性來(lái)源主要包括樣品前處理過(guò)程與基因測(cè)序無(wú)法做到完全一致所致〔21〕。因此，采用多種方法檢測(cè)，可有效降低檢測(cè)的假陽(yáng)性率及假陰性率。另外，本研究提示，只要樣本采集及制作過(guò)程有效避免相關(guān)因素干擾，3種檢測(cè)均可達(dá)到較為理想的檢測(cè)結(jié)果。

綜上，基于免疫組化及Western印跡技術(shù)，選用IDH1 R132H基因突變的特異性抗體IMab-1，可有效檢出早期腦膠質(zhì)瘤的進(jìn)展?fàn)顩r，可為膠質(zhì)瘤IDH1基因突變的篩選及相關(guān)疾病的預(yù)后評(píng)估提供理論依據(jù)。