澤瀉多糖對老年性耳鳴耳聾的治療

張蕊 李羿 宋麗

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610500)

隨著年齡增長，老年人的聽覺器官開始衰老退變，雙耳出現(xiàn)進行性和對稱性的聽力減退或無刺激感音，稱為老年性耳鳴耳聾〔1〕。目前，我國65歲以上老年人該病發(fā)病率高達(dá)33%～48%。并且隨著社會的老齡化，發(fā)病率正迅速上升〔2〕，因為老年性耳鳴耳聾發(fā)病機制復(fù)雜，再加上研究的起步比較晚，因此目前我國對該病的文獻報道較少，治療藥物也不多。中醫(yī)理論認(rèn)為老年多虛，多虛則久聾。隨著年齡增長，老年人精氣衰減，致使精氣不足而難以滋養(yǎng)耳部，出現(xiàn)耳鳴耳聾。因此，老年性耳鳴耳聾的治療可以從抗衰老、補精氣方面入手〔3〕。例如，具有補腎益氣功效的六味地黃丸、耳聾左慈丸等用于治療耳鳴耳聾，療效較好。這些方劑中都含有澤瀉配伍〔4,5〕。澤瀉為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥塊莖〔6〕。目前澤瀉的研究重心多在其脂溶性部分，而較少關(guān)注水溶性部分〔7〕。實驗表明，澤瀉中水溶性活性成分多糖具有顯著的抗氧化、抗衰老和提高免疫力作用〔8〕，對老年性耳鳴耳聾的治療具有一定的積極意義。本研究旨在探討澤瀉多糖對老年性耳鳴。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物：昆明種小鼠，SPF級，雄性，體重20 g左右，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司〔動物合格證號：SCXK(川)2013-24〕。試劑與儀器：數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；電子分析天平(YP202N，上海菁海儀器有限公司)；紫外可見分光光度計(UV752N，上海佑科儀器儀表有限公司)。澤瀉藥材(180801，四川彭山產(chǎn)，四川新荷花中藥飲片股份有限公司)，經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院李羿教授鑒定為澤瀉科植物澤瀉Alisma orientale (Sam.)Juzep.的干燥塊莖。丙二醛(MDA)試劑盒(A003-1-2，南京建成生物工程研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(A001-2-1，南京建成生物工程研究所)；D-無水葡萄糖對照品(MUST-18032905，成都曼思特生物科技有限公司)；D-半乳糖(G1804160，陜西潤豐生物技術(shù)有限公司)。

1.2澤瀉多糖的提取純化 采用水提醇沉法〔9〕提取澤瀉中的多糖類成分，Sevag法〔10〕除去粗多糖中的蛋白質(zhì)雜質(zhì)。取澤瀉粉末(65目)，按料液比1∶10加入蒸餾水，于100℃下浸提3 h。抽濾，濃縮濾液。加入一定體積無水乙醇，待沉淀完全后抽濾，濾渣用無水乙醇和乙醚洗滌兩次，干燥，得澤瀉多糖粗品。粗品加水溶解后加入Sevag溶液(氯仿∶正丁醇4∶1)5 ml，以4 000 r/min離心10 min，分離上清液。揮干溶劑，干燥，即得。

1.3澤瀉多糖的含量測定

1.3.1對照品溶液的制備 精密稱取對照品D-無水葡萄糖，加入一定量的蒸餾水使其溶解，配成100 mg/L對照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備 精密稱取1.2中制備的澤瀉多糖，加入一定量的蒸餾水使其溶解，再加1 mol/L的H2SO42 ml，加熱水解2 h，冷卻至室溫，配成100 mg/L供試品溶液。

1.3.3含量測定方法 精密量取1.3.2中制備的供試品溶液2 ml，加5%苯酚溶液1.5 ml和濃硫酸7.5 ml，混勻，靜置20 min顯色，在484 nm處測定吸光度，計算澤瀉多糖的含量。

1.4澤瀉多糖抗老年耳鳴耳聾的活性研究

1.4.1給藥供試品溶液的制備 稱取5 g1.2中制備的澤瀉多糖，用150 ml 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液分散。

1.4.2老年性耳鳴耳聾小鼠模型的建立 將小鼠隨機分成模型組，澤瀉多糖組(均按500 mg/kg劑量腹腔注射D-半乳糖)，空白組(腹腔注射等量生理鹽水)。每天一次，連續(xù)給藥70 d。

1.4.3給藥與取樣 按375 mg/kg劑量灌胃給予澤瀉多糖組小鼠1.4.1中制備的供試品溶液；按同等劑量灌胃給予空白組、模型組生理鹽水，每天一次，連續(xù)給藥28 d后，取小鼠腦組織和血清。

1.4.4血清中SOD值和MDA值的測定 采用試劑盒對小鼠血清中SOD值和MDA值進行測定。

1.4.5大腦組織聽皮層病理檢測 小鼠大腦組織標(biāo)本按病理檢驗SOP程序進行脫水、修剪、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片等，最后鏡檢。測量聽皮層正常神經(jīng)元及異常神經(jīng)元數(shù)量，并計算異常神經(jīng)元百分比。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1澤瀉多糖的含量測定結(jié)果 通過1.3.3中方法測定澤瀉多糖的含量分別為53.92%、56.04%、54.38%、55.80%、 53.22%、55.30%，平均含量為54.78%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.04%。

2.2血清MDA、SOD測定結(jié)果 與空白組比較，模型組血清SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高(P<0.05)；澤瀉多糖組血清SOD活力較模型組顯著增大，MDA含量顯著降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組MDA、SOD測定結(jié)果

2.3大腦組織聽皮層病理檢測結(jié)果 與空白組比較，模型組大腦中聽皮層內(nèi)神經(jīng)元出現(xiàn)較明顯損害，異常神經(jīng)元數(shù)量及比例增多(P<0.05)；與模型組比較，澤瀉多糖組大腦中聽皮層內(nèi)神經(jīng)元損害程度變化不明顯，異常神經(jīng)元數(shù)量及比例降低，不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。空白組：大腦組織結(jié)構(gòu)完整，未見明顯的炎性滲出；聽皮層內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊；異常神經(jīng)元小量，細(xì)胞顏色變深，體積縮小，內(nèi)部結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核較模糊，細(xì)胞尾部偶然可見較為明顯的軸突樣結(jié)構(gòu)；細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)毛細(xì)血管豐富，神經(jīng)纖維較均勻，膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，與神經(jīng)元相比體積較小，未見明顯的增生、壞死和炎性細(xì)胞浸潤。模型組：聽皮層內(nèi)部分神經(jīng)元壞死，細(xì)胞體積縮小，排列紊亂；細(xì)胞核縮小，細(xì)胞周圍間隙變寬；細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)的毛細(xì)血管、神經(jīng)纖維及膠質(zhì)細(xì)胞等無明顯增生、壞死和炎性細(xì)胞浸潤。澤瀉多糖組聽皮層內(nèi)部分神經(jīng)元壞死，細(xì)胞體積縮小，但排列較整齊；細(xì)胞核縮?。患?xì)胞間質(zhì)內(nèi)的毛細(xì)血管、神經(jīng)纖維及膠質(zhì)細(xì)胞等無明顯增生、壞死和炎性細(xì)胞浸潤。見表2和圖1。

表2 各組聽皮層病理檢測結(jié)果

↑：壞死神經(jīng)元圖1 各組聽皮層鏡檢結(jié)果

3 討 論

老年性耳鳴耳聾的病因復(fù)雜多樣，耳蝸螺旋器、基底膜等老化可引起感音障礙；中樞神經(jīng)、內(nèi)耳神經(jīng)等退化可引起傳導(dǎo)障礙；慢性疾病如高血壓、高脂血癥等可造成血管腔狹窄，內(nèi)耳供血不足；缺乏鋅元素可影響耳蝸功能等。目前的藥物主要是針對內(nèi)耳供血不足進行治療，如擴血管藥、降低血液黏稠度和溶解小血栓的藥物及B族維生素等。

本文采用注射D-半乳糖來構(gòu)建老年性耳鳴耳聾動物模型〔11〕。因為D-半乳糖可使機體細(xì)胞(包括聽覺細(xì)胞)內(nèi)氧化酶的活性改變，引發(fā)脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)，產(chǎn)生各種氧化產(chǎn)物(如MDA)，引起細(xì)胞的老化損害和功能減退，從而導(dǎo)致機體衰老和聽力障礙。SOD可幫助消除體內(nèi)的氧自由基，減少細(xì)胞的氧化損害和老化凋亡〔12〕。鏡檢時，空白組動物大腦聽皮層內(nèi)偶見少量深色神經(jīng)元，可能是由于腦組織樣本在前期處理過程中極易受到外界各種因素的影響而造成的人工假象。本研究結(jié)果說明澤瀉多糖具有較好的清除自由基和抗自由基損害的作用，能夠較好地保護耳蝸細(xì)胞，從而對老年性耳鳴耳聾的治療具有積極意義。但光鏡下大腦組織聽皮層神經(jīng)元損害程度和異常神經(jīng)元百分比均下降不明顯，可能是由于飼養(yǎng)過程中部分老鼠死于打斗引起的創(chuàng)傷性感染，導(dǎo)致樣本數(shù)量減少，再加上取樣的局部性，使鏡檢結(jié)果僅能代表現(xiàn)有組織切片的病理趨勢，因此后續(xù)研究中應(yīng)進一步擴大樣本量，增大給藥劑量或延長給藥時間。