老年2型糖尿病小鼠記憶損害和大腦內(nèi)proBDNF-p75NTR表達(dá)

熊靜 邢維昊 李舒婷 張曉琳 劉鳳 巫曉宇

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，云南 昆明 650101)

癡呆已經(jīng)成為老年人群致死和致殘的主要疾病之一。中國(guó)現(xiàn)有癡呆患者約1 000萬(wàn)，到2050年，癡呆患者預(yù)計(jì)達(dá)到4 000萬(wàn)〔1，2〕。2型糖尿病(T2DM)是阿爾茨海默病(AD)和血管性癡呆的重要危險(xiǎn)因素。T2DM患者AD發(fā)病率是非T2DM者的1.5倍，對(duì)老年人影響更為明顯〔3〕。T2DM 發(fā)病增加，加上年齡增長(zhǎng)和肥胖的代謝后果，顯著增加了認(rèn)知能力下降和癡呆的發(fā)病〔4〕。T2DM、肥胖和AD 存在著胰島素抵抗、腦小血管損傷、炎癥和氧化應(yīng)激等共同的病理生理機(jī)制〔5〕，但T2DM與認(rèn)知損害之間的分子機(jī)制仍不清楚。近年來(lái)，連接大腦、內(nèi)分泌胰腺、脂肪組織的神經(jīng)信號(hào)通路功能障礙越來(lái)越受到重視〔6〕。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)在哺乳動(dòng)物腦內(nèi)含量豐富〔7〕，也存在于外周神經(jīng)、骨骼肌、平滑肌、肝臟、淋巴細(xì)胞、內(nèi)分泌系統(tǒng)、胰腺、內(nèi)皮細(xì)胞和脂肪組織中〔8〕。BDNF在學(xué)習(xí)和記憶中有重要的作用，與AD等神經(jīng)變性疾病密切相關(guān)〔9〕。BDNF在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中先合成BDNF前體蛋白(proBDNF)，proBDNF在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外經(jīng)過(guò)一系列蛋白酶剪切形成成熟型BDNF(mature BDNF)〔7，10〕。研究表明，proBDNF和mature BDNF分別通過(guò)p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75NTR)和酪氨酸激酶受體(Trk)B結(jié)合，在學(xué)習(xí)和記憶中起相反的生物學(xué)作用〔7，9,10〕。

研究發(fā)現(xiàn)肥胖、T2DM、神經(jīng)變性疾病患者血清中BDNF基因表達(dá)水平降低〔11，12〕。T2DM損害學(xué)習(xí)和記憶的部分原因是通過(guò)下調(diào)BDNF表達(dá)，改變了突觸可塑性〔13〕。目前，還沒(méi)有研究報(bào)道T2DM對(duì)腦內(nèi)proBDNF水平或proBDNF與mature BDNF比值及其相應(yīng)的受體p75NTR和TrkB的影響。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)8周齡C57BL/6小鼠，建立T2DM模型，并持續(xù)到小鼠老年期，測(cè)定T2DM小鼠短期記憶和空間參考記憶損傷和腦內(nèi)proBDNF-p75NTR和mature BDNF-TrkB的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡C57BL/6雌性小鼠，分為T2DM組(n=8)和對(duì)照組(n=8)。T2DM組給予高脂飲食，對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，喂養(yǎng)30 w至小鼠38周齡。標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌條件，室溫22℃，濕度55%，12 h∶12 h光照-黑暗周期飼養(yǎng)。

1.2主要試劑和儀器 主要試劑：proBDNF和mature BDNF酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(澳大利亞南澳大學(xué)周新富教授贈(zèng)送)，p75NTR ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)，TrkB ELISA試劑盒(Sino Biological Inc.)，TRIzoL試劑盒(美國(guó) Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR試劑盒(美國(guó) Qiagen公司)，引物(Invitrogen公司合成)。主要儀器：ABI 7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

1.3小鼠體重、空腹血糖、葡萄糖耐量測(cè)定(GTT)和胰島素耐量測(cè)定(ITT) 小鼠入組時(shí)測(cè)定基礎(chǔ)體重和空腹血糖，之后每周測(cè)量體重，每4周測(cè)量空腹血糖?？崭寡窃诮尺^(guò)夜16 h后，尾靜脈采血測(cè)定。小鼠38 w時(shí)，進(jìn)行GTT和ITT。GTT在小鼠禁食16 h后進(jìn)行，測(cè)量空腹血糖后給予腹腔內(nèi)注射葡萄糖(1 g/kg)，分別于注射后15、30、60、90、120 min重復(fù)測(cè)定。ITT在小鼠禁食5 h后進(jìn)行，測(cè)定基線血糖后，給予胰島素腹腔注射(0.75 U/kg)，分別于注射后15、30、60、90和120 min重復(fù)測(cè)定。

1.4Y迷宮空間識(shí)別實(shí)驗(yàn)和自發(fā)交替實(shí)驗(yàn) 采用Y迷宮空間識(shí)別實(shí)驗(yàn)和自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠的短期記憶。Y迷宮由3個(gè)完全相同的臂組成，形成Y形。中央處各有一個(gè)可移動(dòng)的隔板。Y迷宮空間識(shí)別實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)述如下：3個(gè)臂隨機(jī)設(shè)為新異臂、起始臂和其他臂。實(shí)驗(yàn)的第1個(gè)階段(訓(xùn)練期)，用隔板擋住新異臂，開(kāi)放起始臂和其他臂，將小鼠自起始臂放入，在兩個(gè)開(kāi)放的臂中自由活動(dòng)探索3 min。2 h后進(jìn)行第2階段(回憶期)，打開(kāi)新異臂，將小鼠自起始臂放入，在3個(gè)臂中自由活動(dòng)3 min。Anymaze軟件記錄小鼠在各臂中的活動(dòng)時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)，計(jì)算新異臂中活動(dòng)時(shí)間的百分比，進(jìn)入新異臂次數(shù)的百分比。3 d后進(jìn)行Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)，測(cè)試前將Y迷宮旋轉(zhuǎn)45°，將小鼠自任意一臂中放入，自由活動(dòng)5 min，Anymaze軟件記錄小鼠進(jìn)入各個(gè)臂的順序和次數(shù)，計(jì)算自發(fā)交替百分比。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 用Morris水迷宮測(cè)試來(lái)測(cè)量空間參考記憶。水迷宮裝置由一個(gè)圓形聚丙烯池(直徑120 cm×高45 cm)，池周有4種不同圖案提示，以幫助小鼠定位。水溫保持在(23±1)℃，加入無(wú)毒的白色涂料使水不透明。第1天為適應(yīng)期，將小鼠平臺(tái)所在象限(目標(biāo)象限)面向池壁放入水中，自行游泳2 min。第2天進(jìn)行可見(jiàn)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，使平臺(tái)露出水面0.5 cm，觀察小鼠分別從四個(gè)象限的某一固定點(diǎn)入水至爬上平臺(tái)的時(shí)間，小鼠若超過(guò)60 s找不到平臺(tái)，可引導(dǎo)其找到平臺(tái)。第3～6天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)：將平臺(tái)隱入水下1 cm，再將小鼠面向并靠近池壁分別從四個(gè)不同象限入水，Anymaze軟件記錄小鼠從入水到爬上平臺(tái)的游泳時(shí)間(逃避潛伏期)和在目標(biāo)象限內(nèi)的游泳時(shí)間。第7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，移除平臺(tái)，給予小鼠60 s探索時(shí)間，Anymaze軟件記錄小鼠在原平臺(tái)所在位置區(qū)域的時(shí)間和穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.6RT-PCR檢測(cè)小鼠腦組織BDNF、TrkB和p75NTR mRNA表達(dá) 采用CO2窒息法，人道處死小鼠，取出腦組織，液氮中速凍后貯存于-80℃冰箱備用。用TRIzoL試劑提取小鼠大腦總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR測(cè)定BDNF、p75NTR、TrkB基因在小鼠腦組織中的轉(zhuǎn)錄水平。RT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10 min，95℃ 15 s，循環(huán)40次，60℃ 1 min，引物序列：BDNF正向：5′-TACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCC-3′，反向：5′-ACTTGACTACTGAGCA-TCACCCTG-3′；p75NTR正向：5′-GTGGGACAGA-GTCTGGGTGT-3′，反向：5′-AAGGAGGGGAGGTGATAGGA-3′；TrkB正向：5′-AGGGCAACCCGCCCACGGAA-3′，反向：5′-GGATCGGTCTGGGGAAAAG-3′；β-actin正向：5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反向：5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果通過(guò)β-actin結(jié)果進(jìn)行矯正，應(yīng)用2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析〔14〕。

1.7ELISA測(cè)定小鼠腦組織proBDNF、成熟(mature)BDNF、TrkB和p75NTR蛋白 用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)蛋白裂解液提取腦組織蛋白。Mature BDNF ELISA測(cè)定〔14,15〕簡(jiǎn)述如下：G蛋白純化的小鼠抗-mature BDNF單克隆抗體(工作濃度1 μg/ml)包被酶標(biāo)板，37℃ 1 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板，3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h。加樣：標(biāo)準(zhǔn)品為重組mature BDNF蛋白，倍比稀釋加入，范圍在0～2 000 pg/ml，加入腦組織樣本(濃度250 μg/ml)，37℃，1 h，PBST洗板，加入檢測(cè)抗體—生物素標(biāo)記的羊抗mature BDNF抗體(工作濃度0.15 μg/ml)，37℃，1 h。PBST洗板，加入鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，37℃，1 h，PBST洗板，加入新鮮配制的TMB底物，室溫避光，10～15 min內(nèi)顯色。加入0.1 mol/L Hcl終止反應(yīng)，用Model 2550 EIA reader于450 nm讀取OD值。 ProBDNF測(cè)定步驟同mature BDNF〔15〕。包被抗體為G蛋白純化的羊抗-proBDNF單克隆抗體(工作濃度為5 μg/ml)，標(biāo)準(zhǔn)品為重組proBDNF蛋白，范圍在0～2 000 pg/ml，腦組織樣品濃度為250 μg/ml，檢測(cè)抗體為生物素標(biāo)記的羊抗proBDNF抗體(工作濃度0.15 μg/ml)。P75NTR和TrkB測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立T2DM模型 T2DM組平均體重〔(54.36±2.68)g〕明顯高于對(duì)照組〔(23.66±1.62)g,t=11.40，P<0.01〕。T2DM組平均空腹血糖〔(8.22±0.41)mmol/L〕明顯高于對(duì)照組〔(4.45±0.22)mol/L,t=36.69，P<0.01〕。GTT實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，T2DM組葡萄糖耐量受損，注射葡萄糖后血糖升高的峰值延遲，60 min達(dá)到峰值，之后緩慢下降，至注射后120 min時(shí)，血糖仍明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。ITT中，與對(duì)照組相比，T2DM小鼠對(duì)胰島素的敏感性降低。T2DM組給予胰島素腹腔注射后，血糖水平降低的幅度更小，并且更快地開(kāi)始恢復(fù)，注射胰島素后120 min，T2DM組血糖明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表1、表2。

2.2Y迷宮實(shí)驗(yàn)中T2DM組小鼠短期工作記憶下降 T2DM組在新異臂內(nèi)活動(dòng)時(shí)間百分比、進(jìn)入新異臂的次數(shù)占總次數(shù)百分比、自發(fā)交替率較對(duì)照組均明顯減少(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 兩組GTT結(jié)果

表2 兩組ITT結(jié)果

表3 兩組Y迷宮結(jié)果

2.3Morris水迷宮測(cè)試中T2DM小鼠空間參考記憶下降 定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組逃跑潛伏期逐漸縮短，在目標(biāo)象限的時(shí)間逐漸增加，T2DM組小鼠的比對(duì)照組小鼠長(zhǎng)，在目標(biāo)象限中的時(shí)間更短(P<0.05)。表明T2DM小鼠學(xué)習(xí)速度下降。見(jiàn)表4。空間探索試驗(yàn)顯示，移除平臺(tái)后，T2DM小鼠在之前平臺(tái)所在區(qū)域的時(shí)間〔(1.73±0.04)s〕明顯少于對(duì)照組〔(1.93±0.04)s，P<0.05〕；T2DM小鼠進(jìn)入之前平臺(tái)所在區(qū)域的次數(shù)〔(3.00±0.21)次〕明顯少于對(duì)照組〔(4.12±0.22)次，P=0.003〕，說(shuō)明T2DM小鼠的空間參考記憶受損。

表4 兩組水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4T2DM小鼠腦內(nèi)BDNF、TrkB和p75NTR mRNA表達(dá)變化 與對(duì)照組相比，T2DM組BDNF mRNA、TrkB mRNA均顯著下調(diào)(P<0.01)，而p75NTR mRNA顯著上調(diào)(P<0.01)。見(jiàn)表5。

2.5T2DM組大腦中proBDNF、mature BDNF、TrkB和p75NTR蛋白的變化 T2DM組proBDNF、p75NTR水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，T2DM組mature BDNF、TrkB水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表6。

表5 兩組腦BDNF、TrkB和

表6 兩組腦內(nèi)proBDNF、mature BDNF、TrkB和p75NTR蛋白濃度比較

3 討 論

高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠建立的T2DM模型，表現(xiàn)為肥胖、血糖升高和胰島素抵抗。這個(gè)模型被認(rèn)為是一個(gè)非常有效的胰島素抵抗和T2DM模型〔16〕。既往研究認(rèn)為，T2DM對(duì)認(rèn)知的損傷在老年期更明顯〔3〕，因此本研究持續(xù)到小鼠老年期(38周齡)。本研究結(jié)果說(shuō)明T2DM促進(jìn)了老年小鼠的短期工作記憶和空間參考長(zhǎng)期記憶的下降。有研究表明，肥胖、T2DM、神經(jīng)退行性疾病患者血清中BDNF水平較低〔11，17〕。T2DM患者血清BDNF 濃度與延遲記憶損傷相關(guān)〔12〕，而伴有T2DM的癡呆患者BDNF 平均水平最低〔18〕。BDNF水平降低可能在T2DM患者的認(rèn)知障礙病理生理學(xué)改變中發(fā)揮重要作用〔19〕。因此，T2DM引起小鼠腦中BDNF基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)，與小鼠的短期和空間參考記憶損傷有關(guān)。

BDNF基因轉(zhuǎn)錄后，先合成proBDNF，proBDNF在細(xì)胞內(nèi)由furin蛋白酶或前蛋白轉(zhuǎn)化酶剪切形成mature BDNF。分泌到細(xì)胞外proBDNF由組織纖維蛋白溶解酶(tPA)或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)轉(zhuǎn)化形成mature BDNF〔7，10〕。兩種BDNF有相反的生物學(xué)作用，proBDNF/mature BDNF平衡對(duì)神經(jīng)元可塑性和神經(jīng)元連續(xù)更新有重要作用〔10，20〕。

和mature BDNF促進(jìn)神經(jīng)元的存活、增加突觸可塑性、促進(jìn)記憶〔9〕的作用相反，proBDNF是一種強(qiáng)大的神經(jīng)退行性疾病促進(jìn)因子〔21〕。AD患者內(nèi)嗅皮層及額葉皮質(zhì)中的proBDNF水平降低，皮層區(qū)總BDNF水平與海馬區(qū)Aβ淀粉樣蛋白呈負(fù)相關(guān)，血清proBDNF與pTau染色呈正相關(guān)，TrkB水平下降，與同一區(qū)域的Aβ和pTau水平呈負(fù)相關(guān)〔22〕。proBDNF誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)海馬神經(jīng)元的長(zhǎng)時(shí)程抑制〔21〕。BDNF肽鏈上furin位點(diǎn)突變，引起小鼠大腦海馬區(qū)proBDNF水平升高，導(dǎo)致樹(shù)突分化減少和棘突密度降低，海馬體積變小，損害初級(jí)突觸傳遞功能，增強(qiáng)長(zhǎng)時(shí)程抑制功能。向高齡老鼠海馬內(nèi)注射proBDNF后，海馬區(qū)新生神經(jīng)細(xì)胞減少，相反，給予proBDNF抗體可抵消這種不良影響〔23，24〕。

proBDNF是一個(gè)強(qiáng)大的神經(jīng)退行性疾病促進(jìn)因子，通過(guò)激活p75NTR 和sortilin受體復(fù)合物，顯著抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖、減少神經(jīng)元分化、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致神經(jīng)突起塌陷、神經(jīng)元凋亡和抑制神經(jīng)發(fā)生〔21〕，損害認(rèn)知功能〔7，10〕。研究表明，T2DM患者出現(xiàn)高血糖水平時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞中p75NTR水平增加〔25〕。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF參與了體重和糖代謝的調(diào)節(jié)。BDNF通過(guò)TrkB，增加能量消耗，控制體重增加，改善血糖平衡，提高胰島素敏感性〔6〕。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR參與了調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和胰島素抵抗。p75NTR基因敲除小鼠，胰島素敏感性增加，能量消耗增加〔26〕。綜上，T2DM可引起老年小鼠腦內(nèi)mBDNF、proBDNF及其受體的異常調(diào)節(jié)，與T2DM相關(guān)的記憶障礙有關(guān)。有必要在今后的研究中，探索調(diào)節(jié)proBDNF和mature BDNF的生物合成過(guò)程，如改變飲食和運(yùn)動(dòng)，增加mature BDNF的正性作用或降低proBDNF負(fù)性作用，或阻斷p75NTR信號(hào)通路，能否同時(shí)改善T2DM合并認(rèn)知障礙。