依達(dá)拉奉對(duì)間歇低氧大鼠神經(jīng)細(xì)胞Apaf-1、Survivin蛋白表達(dá)及認(rèn)知功能的影響

王玲 王袁 黃超 張敏 張盼盼 喻昌利

(1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科，河北 唐山 063000；2秦皇島市第一醫(yī)院呼吸科)

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)是由于夜間睡眠過(guò)程中頻繁發(fā)生上呼吸道部分(低通氣)或完全(呼吸暫停)阻塞所致的一種以擾亂正常肺換氣和睡眠結(jié)構(gòu)為主的慢性呼吸障礙性疾病〔1〕。OSAHS因長(zhǎng)期慢性間歇性缺氧可導(dǎo)致多器官多系統(tǒng)損傷，其中以腦功能受損較為顯著，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙〔2〕。依達(dá)拉奉不僅可抑制神經(jīng)元延遲死亡和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，還可保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元免受自由基和氧化應(yīng)激損傷，以達(dá)到改善神經(jīng)功能的作用〔3〕。細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡的主要機(jī)制，與缺氧引起的細(xì)胞死亡密切相關(guān)〔4〕。凋亡肽酶激活因子(Apaf)-1 及存活素(Survivin)是與凋亡密切相關(guān)的相關(guān)因子〔5〕。目前，關(guān)于依達(dá)拉奉對(duì)認(rèn)知功能的影響已有報(bào)道，但對(duì)間歇低氧損傷后凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Survivin表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。本文通過(guò)觀察依達(dá)拉奉對(duì)OSAHS 患者Apaf-1、Survivin蛋白表達(dá)水平的影響，探討依達(dá)拉奉改善認(rèn)知功能障礙的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要儀器、試劑 Apaf-1及Survivin兔抗鼠多克隆抗體、IgG羊抗兔單克隆抗體購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒及PV6001試劑盒購(gòu)自三鷹生物技術(shù)有限公司；低氧箱及氮?dú)?、氧氣?gòu)自唐山市友誼公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 72只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠〔體重(180±10)g〕，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0002。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、5%間歇低氧(IH)組、依達(dá)拉奉組，每組24只，每組又分為10、21、28 d 3個(gè)時(shí)間亞組，每個(gè)時(shí)間亞組8只大鼠。

1.3動(dòng)物模型的制備 制備間歇低氧大鼠動(dòng)物模型。間歇低氧組大鼠低氧箱內(nèi)首先注入30 s的氮?dú)?，流速壓力?.15 MPa，使低氧箱內(nèi)最低氧濃度達(dá)5%，接下來(lái)注入40 s的壓縮空氣，流速壓力為0.8 MPa，使氧濃度升至21%，繼續(xù)注入50 s流速壓力不變的壓縮空氣，使氧濃度維持在21%。上述120 s為1個(gè)周期，反復(fù)進(jìn)行循環(huán)。依達(dá)拉奉組大鼠于間歇低氧實(shí)驗(yàn)前30 min尾靜脈注入依達(dá)拉奉(3 mg/kg)。對(duì)照組大鼠的是實(shí)驗(yàn)箱持續(xù)注入壓縮空氣，流速為3 L/min，控制實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)氧濃度為21%。3組實(shí)驗(yàn)大鼠每日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)8 h，持續(xù)進(jìn)行10、21、28 d。

1.4免疫組化檢測(cè)Apaf-1及Survivin蛋白表達(dá) 固定后的大鼠，腦組織經(jīng)二甲苯透明、切片等制備免疫組織切片。按PV兩步法操作步驟，將準(zhǔn)備好的切片進(jìn)行滴加一抗(Apaf-1兔抗大鼠抗體 1∶500稀釋、Survivin兔抗大鼠抗體1∶500稀釋)、滴加二抗等步驟，最后應(yīng)用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，封片后顯微鏡下攝片。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 每只大鼠于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)試，晨起進(jìn)行穿越平臺(tái)及逃避潛伏期的訓(xùn)練，訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)的測(cè)試，每只大鼠每天上下午各進(jìn)行測(cè)試6次，記錄大鼠的逃避潛伏期時(shí)間及穿越目標(biāo)象限的時(shí)間，取平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和重復(fù)測(cè)量方差分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化檢測(cè)Apaf-1及Survivin蛋白表達(dá) 光學(xué)顯微鏡下顯示，對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Apaf-1及Survivin蛋白表達(dá)較少；與對(duì)照組比較，5%IH組及依達(dá)拉奉組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Apaf-1、Survivin蛋白的表達(dá)明顯增多(P<0.05)；與5%IH組比較，依達(dá)拉奉組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)Apaf-1蛋白表達(dá)均明顯減少，Survivin蛋白表達(dá)均明顯增加(均P<0.05)，見(jiàn)表1，圖1，圖2。

表1 3組不同時(shí)間點(diǎn)Apaf-1表達(dá)比較

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組Apaf-1蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

圖2 光學(xué)顯微鏡下觀察兩組Survivin蛋白表達(dá)(免疫組化，×400)

2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.2.1定位航行實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期無(wú)明顯差異(均P>0.05)；與對(duì)照組比較，5%IH組及依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)；與5%IH組比較，依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期明顯縮短(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2.2空間探索實(shí)驗(yàn) 對(duì)照組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)跨越目標(biāo)象限時(shí)間無(wú)明顯差異(均P>0.05)；與對(duì)照組比較，5%IH組及依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)象限跨越時(shí)間明顯縮短(均P<0.05)；與5%IH組比較，依達(dá)拉奉組各時(shí)間點(diǎn)目標(biāo)象限跨越時(shí)間明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 3組不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期及跨越目標(biāo)象限時(shí)間比較

3 討 論

隨著人們生活水平的提高，肥胖、糖尿病等疾病高發(fā)，OSAHS患病率呈升高趨勢(shì)，是呼吸系統(tǒng)常見(jiàn)病。OSAHS可引起神經(jīng)系統(tǒng)損害，如認(rèn)知功能下降，嚴(yán)重影響人們的生活及工作〔6〕。依達(dá)拉奉作為神經(jīng)內(nèi)科重要的腦保護(hù)藥物，臨床已廣泛應(yīng)用。研究證實(shí)，依達(dá)拉奉可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷進(jìn)而改善認(rèn)知功能〔7〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，間歇低氧損傷造成了大鼠認(rèn)知功能下降，應(yīng)用依達(dá)拉奉干預(yù)后，認(rèn)知功能得到改善。

Apaf-1在凋亡調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，Apaf-1與細(xì)胞色素c和dATP結(jié)合后組成一個(gè)低聚凋亡小體，負(fù)責(zé)自動(dòng)催化活化pro-caspase-9(Apaf-3)，進(jìn)而激活caspase-3和細(xì)胞凋亡〔8〕。Survivin屬于凋亡抑制因子(IAPs)基因家族中分子量最小但抑制凋亡能力最強(qiáng)的一員，其被BIRC5基因編碼，可參與控制有絲分裂、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)3個(gè)細(xì)胞過(guò)程〔9〕。研究報(bào)道，缺氧性腦損傷通過(guò)誘導(dǎo)大鼠腦組織Apaf-1表達(dá)，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加〔10〕。有研究也證實(shí)了間歇低氧可引起Survivin表達(dá)的增加，可能抑制了神經(jīng)元的凋亡〔11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，間歇低氧促進(jìn)了Apaf-1、Survivin蛋白的表達(dá)，加用依達(dá)拉奉干預(yù)后，使促凋亡因子Apaf-1的表達(dá)下降，抑制凋亡因子Survivin蛋白的表達(dá)增加，進(jìn)而改善了認(rèn)知功能。這與既往研究證實(shí)依達(dá)拉奉通過(guò)減少腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡進(jìn)而發(fā)揮腦保護(hù)作用一致〔12〕。

綜上，依達(dá)拉奉可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡因子Apaf-1、Survivin蛋白表達(dá)的水平，進(jìn)而改善間歇低氧損傷后大鼠的認(rèn)知功能。