宮頸癌大鼠模型血清miR-143表達(dá)及其對腫瘤生長的影響機(jī)制

程細(xì)云 申昌梅 余瑛

(贛州市腫瘤醫(yī)院，江西 贛州 341000)

患者在宮頸癌早期可能不會出現(xiàn)明顯癥狀，隨著疾病的逐漸發(fā)展，患者會伴隨經(jīng)期延長、經(jīng)量增多及陰道異常排液，宮頸癌晚期時(shí)腫瘤會壓迫直腸及盆腔神經(jīng)，導(dǎo)致患者排便異常及極度消瘦和困乏〔1～3〕。由于大部分早期宮頸癌患者表現(xiàn)出極強(qiáng)的隱匿性，若不能盡早篩查與確診會延誤最佳治療時(shí)機(jī)，壓迫和侵犯鄰近器官會使宮頸癌的臨床治療更加復(fù)雜，對患者的預(yù)后產(chǎn)生嚴(yán)重影響〔4〕。因此，研究宮頸癌的針對性治療指標(biāo)成為目前宮頸癌的研究重點(diǎn)，其對疾病篩查及靶向治療都有非常重要的臨床意義。miRNA是一類非編碼內(nèi)源性的單鏈核苷酸，不同種類的miRNA被發(fā)現(xiàn)其在腫瘤疾病的發(fā)展中起到促進(jìn)或是抑制的調(diào)控作用〔5～7〕。有學(xué)者指出，人乳頭瘤病毒(HPV)感染機(jī)體過程會表達(dá)特殊miRNA，其異常表達(dá)或許能調(diào)控宮頸癌的進(jìn)展〔8～10〕。miR-143被發(fā)現(xiàn)與多類癌癥疾病存在關(guān)系，并且是患者的一系列臨床特征的有關(guān)影響因素〔11〕，目前，研究miR-143與宮頸癌疾病的資料并不豐富，本研究探討miR-143在宮頸癌大鼠模型血清中的表達(dá)及其對于腫瘤生長的相關(guān)影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要材料及儀器 4～6周齡裸鼠(中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心)、人宮頸癌Hela細(xì)胞株(上海北諾生物科技有限公司)、Trizol試劑盒(上海恒雅生物科技有限公司)、質(zhì)粒提取試劑盒(廣州伯信生物科技有限公司)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海素爾生物科技有限公司)、CD31抗體、胰島素受體底物(IRS)-1抗體、胰島素樣生長因子(IGF)-1受體(R)抗體、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α抗體(賽默飛世爾科技有限公司)、伯恩固定液(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海錦玟儀器設(shè)備有限公司)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀、電泳儀(南京庚辰科學(xué)儀器有限公司)等。

1.2宮頸癌大鼠模型制備 將人宮頸癌Hela細(xì)胞株于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)期，對培養(yǎng)的細(xì)胞行胰酶消化，再放入含胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上停止消化，再通過離心、洗滌操作將細(xì)胞調(diào)至100個(gè)/ml，向建模大鼠腋下注射0.5 ml的Hela細(xì)胞懸液，統(tǒng)一正常飼養(yǎng)7 d后若發(fā)生明顯腫瘤結(jié)節(jié)則代表宮頸癌大鼠模型成功建立，本研究建立宮頸癌模型大鼠10只，另外10只為不做處理的對照組。

1.3定量(q)PCR檢測miR-143水平 建模后14 d抽取兩組大鼠靜脈血液，細(xì)胞裂解處理后進(jìn)行Trizol提取細(xì)胞總RNA，再進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，設(shè)置U6為內(nèi)參基因，根據(jù)miR-143 qPCR試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測定miR-143的相對水平。引物序列：U6正義鏈：5′-GCTGTAGTACTAGTACCGG-3′，反義鏈：5′-CAATGTAAATGTTGGTCAAGTA-3′，220 bp；miR-143正義鏈：5′-AGTAGTATCCCGTAATATAGG-5′，反義鏈：5′-TAAGGTTCTCTCGGATATCATGTA-3′，251 bp。

1.4控制miR-143表達(dá)的裸鼠成瘤試驗(yàn) 將周齡為4～6 w的裸鼠20只隨機(jī)均分為對照(miR-SCR)組與miR-143過表達(dá)(miR-143)組。消化穩(wěn)定細(xì)胞株Hela/miR-143和Hela/miR-SCR，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將4×106個(gè)細(xì)胞稀釋至150 μl，再進(jìn)行裸鼠兩側(cè)皮下注射。常規(guī)飼養(yǎng)12 d后裸鼠皮下腫瘤肉眼可見，供后續(xù)進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)操作和指標(biāo)的檢測。

1.5腫瘤相關(guān)指標(biāo)檢測 ①裸鼠建模24 d后將宮頸癌腫瘤剝離，拍照并測量對照組和miR-143組的腫瘤長、寬、高，計(jì)算體積；②對兩組腫瘤稱重，記錄重量；③從建模飼養(yǎng)的12 d起隔2 d記錄腫瘤體積并繪制兩組的腫瘤體積上升曲線，比較組間差異；④Western印跡檢測兩組裸鼠體內(nèi)宮頸癌腫瘤組織中能夠反映腫瘤增殖情況的生物指標(biāo)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、反映腫瘤微血管形成的生物指標(biāo)CD31抗體及IRS-1、IGF-1R蛋白、HIF-1α的表達(dá)，并進(jìn)行比較；⑤qPCR檢測兩組宮頸癌組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的表達(dá)水平；⑥將兩組腫瘤細(xì)胞用伯恩固定液進(jìn)行固定，然后行常規(guī)免疫組織化學(xué)切片操作，于顯微鏡下觀察各組腫瘤組織中的新生血管數(shù)，并進(jìn)行比較。

1.6雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)預(yù)測miR-143靶基因 通過PicTar、FindTar等生物信息學(xué)軟件對miR-143的靶基因進(jìn)行預(yù)測及篩選，篩選出IRS-1和IGF-1R與miR-143有較高的匹配度，構(gòu)建野生型(WT)質(zhì)粒IRS-1-WT及IGF-1R-WT，和含miR-143序列突變的突變型(MUT)質(zhì)粒IRS-1-MUT及IGF-1R-MUT，通過雙報(bào)告熒光素酶試驗(yàn)分析其與miR-143的相互作用，具體操作按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-143在宮頸癌大鼠血清中表達(dá) miR-143在宮頸癌模型組血清中表達(dá)(0.07±0.01)顯著低于對照組〔(1.03±0.05)；t=15.560,P<0.05〕。

2.2miR-143對腫瘤生長的影響 miR-143組腫瘤從外觀來看也較miR-SCR組顯著變小，見圖1；與miR-SCR組相比，miR-143組腫瘤的長、寬、高及體積均顯著減小(均P<0.01)，見表1；miR-143組腫瘤的重量〔(0.15±0.02)g〕顯著少于miR-SCR組〔(0.45±0.03)g；t=44.577，P<0.05〕；從對腫瘤生長體積的定期監(jiān)測來看，miR-143組腫瘤的生長較miR-SCR組顯著變慢(P<0.05)，且隨天數(shù)的增加兩組體積差逐漸增大(P<0.001)，見表2；miR-143組腫瘤中增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)表達(dá)(0.47±0.10)較miR-SCR組(0.79±0.12)顯著降低(t=9.447，P<0.05)，見圖2。

2.3miR-143對腫瘤新血管生成的影響 免疫組化結(jié)果顯示，miR-143組腫瘤組織中的微血管較miR-SCR組顯著減少，見圖3；miR-143組腫瘤組織中的CD31抗體的表達(dá)(30.31±1.21)較miR-SCR組(70.33±2.45)顯著降低(t=79.196，P<0.05)。

2.4miR-143靶基因預(yù)測 生物信息學(xué)軟件預(yù)測到IRS-1和IGF-1R與miR-143有相匹配的基因序列，見圖4。WT預(yù)測基因序列及含miR-143靶向序列MUT預(yù)測基因序列構(gòu)建正確，見圖5。miR-143組IRS-1-WT及IGF-1R-WT熒光素酶活性較miR-SCR組顯著降低(P<0.05)；miR-143組IRS-1-MUT及IGF-1R-MUT熒光素酶活性與miR-SCR組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表3。

圖1 miR-143對腫瘤形態(tài)的影響

表1 miR-143對腫瘤體積的影響

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤體積比較

圖2 miR-143對腫瘤PCNA表達(dá)水平的影響

圖3 免疫組化顯微鏡下觀察兩組微血管數(shù)量(×400)

圖4 miR-143靶基因預(yù)測

圖5 WT及MUT報(bào)告基因測序

表3 miR-143對靶點(diǎn)報(bào)告基因熒光素酶活性影響

2.5miR-143對靶基因的調(diào)控 Western印跡檢測宮頸癌組織中的IRS-1、IGF-1R蛋白水平發(fā)現(xiàn)，miR-143組的IRS-1、IGF-1R蛋白表達(dá)(0.63±0.18、0.85±0.33)較miR-SCR組(1.22±0.23、1.37±0.27)顯著降低(t=16.799，P=0.000；t=13.625，P=0.001)，miR-143組HIF-1α蛋白表達(dá)(0.52±0.03)較miR-SCR組(1.24±0.05)顯著降低(t=11.567，P=0.003)，miR-143組VEGF mRNA表達(dá)水平(0.34±0.02)較miR-SCR組(1.06±0.14)顯著降低(t=19.544，P=0.000)，見圖6、圖7。

圖6 兩組IRS-1、IGF-1R、HIF-1α蛋白表達(dá)

圖7 兩組VEGF mRNA表達(dá)

3 討 論

近年miRNA在腫瘤疾病中的研究取得了很多突破性發(fā)現(xiàn)，同種miRNA在不同腫瘤疾病中發(fā)揮的作用不完全相同，涉及調(diào)控機(jī)制存在很大差異〔12〕。研究miRNA對腫瘤疾病的作用、表達(dá)的高低、其調(diào)控疾病過程中靶基因的確定對判斷該miRNA的促癌或抗癌作用十分必要，這也為腫瘤早期的臨床診斷及治療靶點(diǎn)提供了關(guān)鍵參考。研究發(fā)現(xiàn)，miR-143在包括膀胱癌、胃癌和乳腺癌等眾多腫瘤疾病中出現(xiàn)異常表達(dá)現(xiàn)象，推測與其對腫瘤的相關(guān)生物學(xué)調(diào)控有關(guān)〔13～15〕。研究指出IGF-1R作為一類與細(xì)胞生長及胚胎發(fā)育相關(guān)的細(xì)胞因子在很多類型細(xì)胞中都有表達(dá)，并且在腫瘤疾病中，IGF-1R作為重要的促癌因子促進(jìn)癌細(xì)胞增殖及機(jī)體正常細(xì)胞發(fā)生癌變〔16～18〕。IRS-1能幫助胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，在多種腫瘤中的表達(dá)顯著上升，在腫瘤形成、增殖、侵襲等惡性生物學(xué)行為中扮演重要角色，是腫瘤標(biāo)志物之一〔19〕。而IGF-1R/IRS-1下游調(diào)控的低氧誘導(dǎo)分子HIF-1α和VEGF能通過進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤微血管的生成推進(jìn)腫瘤疾病的進(jìn)程〔20〕。

本研究中miR-143宮頸癌大鼠模型在很好地模擬miR-143體內(nèi)功能的同時(shí),還能夠進(jìn)一步推進(jìn)臨床試用新型治療靶點(diǎn)的進(jìn)程。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-143能夠有效抑制模型大鼠體內(nèi)宮頸癌腫瘤的生長，且IRS-1、IGF-1R是miR-143的靶向調(diào)控基因。本研究首先確定了miR-143于宮頸癌大鼠模型中低表達(dá)，進(jìn)一步構(gòu)建miR-143過表達(dá)的裸鼠模型，確定其表達(dá)對腫瘤生長的影響及相關(guān)機(jī)制，推進(jìn)了臨床治療宮頸癌疾病試用新型治療靶點(diǎn)的進(jìn)程，由于其中涉及分子及通路復(fù)雜，更加全面的研究需要進(jìn)行多次的多樣化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和理論討論。

綜上，miR-143在宮頸癌大鼠血清中顯著低表達(dá)，高表達(dá)的miR-143抑制腫瘤的生長，其調(diào)控機(jī)制可能與miR-143抑制腫瘤微血管生成及抑制促腫瘤生長的IRS-1、IGF-1R表達(dá)從而抑制其下游HIF-1α、VEGF的表達(dá)有關(guān)。