烏參醒腦湯對帕金森病大鼠行為學(xué)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/ATF4通路的影響*

于楠楠，畢海洋，匡禹霏，孫殿甲

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省老年病醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150016）

帕金森?。≒arkinson's disease, PD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，多發(fā)于老年群體，臨床上表現(xiàn)為靜止性戰(zhàn)栗、運(yùn)動(dòng)減少、步態(tài)異常等，發(fā)病原因較復(fù)雜。有研究顯示，年齡增長、氧化應(yīng)激過度等均可引起黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)中多巴胺能神經(jīng)元變性死亡，促進(jìn)PD 的發(fā)展[1]。目前西醫(yī)主要通過抗膽堿能藥物、多巴胺受體激動(dòng)劑等對癥治療，用藥后癥狀明顯改善，但長期使用毒副作用較大[2]。此外手術(shù)治療也有明顯效果，但術(shù)后并發(fā)癥多，且極易復(fù)發(fā)[3]。近年來，中醫(yī)治療PD 有一定成效，并且中藥毒副作用低，值得臨床參考[4]。中醫(yī)認(rèn)為，PD 的病位在腦，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)癥，虛癥以氣血兩虛和肝腎虧虛為主，實(shí)證在于風(fēng)、淤、痰[5]。2010 版《中華人民共和國藥典》[6]收錄了“人參首烏膠囊”一方，具有益氣補(bǔ)血、補(bǔ)肝養(yǎng)腎的功效，可治療神經(jīng)衰弱、失眠健忘等癥。本研究在此方基礎(chǔ)上根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)加入黃芪、當(dāng)歸、川芎、銀杏葉、三七粉、蒲黃，在補(bǔ)腎養(yǎng)肝的基礎(chǔ)上起到通腦絡(luò)、養(yǎng)氣血、通淤堵的作用。本研究探究配伍而成的烏參醒腦湯對帕金森病大鼠的行為學(xué)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK/ATF4 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

48 只雄性SD 大鼠，體重（220±20）g，SPF 級，購自上海昇敞生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2021-0002；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（滬）2021-0009。正常飼喂、飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑烏參醒腦湯方中人參、首烏、黃芪、當(dāng)歸、川芎、銀杏葉、三七粉和蒲黃（北京同仁堂大藥房），6-羥基多巴胺（6-OHDA）（批號：636-00-0）、鹽酸阿撲嗎啡（批號：314-19-2）（上海源葉生物科技有限公司），Total RNA Extraction Kit（批號：R1200）、Universal RT-PCR Kit（批號：RP1100）、動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒（柱式法）（批號：BC3790-50T）、BCA 試劑盒（批號：PC0020）（北京索萊寶科技有限公司），蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase, PERK）、轉(zhuǎn)錄活化因子4（activating transcription factor 4, ATF4）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homology protein, CHOP）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2基因（BCL2-associated X, Bax）、β-actin 兔抗大鼠一抗、HPR 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗（美國Abcam 公司）。

1.2.2 主要儀器數(shù)顯式腦立體定位儀DB006-1、SMART 3.0 動(dòng)物行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)Smart 3.0（北京智鼠多寶生物科技有限公司），光學(xué)顯微鏡Axio Lab.A1（北京普瑞賽司儀器有限公司），Qtower96G 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）儀（德國椰拿分析儀器股份公司），全自動(dòng)樣品快速研磨儀-24L（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 烏參醒腦湯的制備稱取人參12 g、首烏12 g、銀杏葉10 g、黃芪8 g、當(dāng)歸6 g、川芎6 g、三七粉3 g、蒲黃5 g，冷水浸泡30 min，取出瀝干水分，置于砂鍋中，加適量自來水頭煎煮沸后25 min 關(guān)火，倒出湯劑，加適量自來水再煎，煮沸后20 min 關(guān)火，撈出藥渣，將頭煎和二煎的湯劑混合，濃縮至20 mL，生藥濃度為3.1 g/mL 的混懸液，置于4℃冷藏備用。

1.3.2 模型的復(fù)制與鑒定參照張輝等[7]的研究，復(fù)制PD 大鼠模型。模型復(fù)制前12 h 禁食，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其固定在腦立體定位儀上，剔去顱頂毛發(fā)，沿頭部中線切開頭皮，暴露顱骨。參考PAXINOS 等[8]的大鼠腦部立體定向圖譜，利用定位坐標(biāo)法定位大鼠左側(cè)紋狀體（striatum,CPU）的坐標(biāo)（前囟后1.00 mm，中線左3.00 mm，硬膜下5.00 mm），于該點(diǎn)向大鼠左側(cè)CPU 內(nèi)注射0.2%6-OHDA（生理鹽水稀釋），留針5 min，緩慢退針，縫合好傷口后表面涂抹青霉素防止感染。模型復(fù)制3 d 后觀察到大鼠步態(tài)失調(diào)，肢體震顫，行動(dòng)遲緩，即模型復(fù)制成功。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組與給藥將48 只大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、低劑量組、高劑量組，每組12 只。模型復(fù)制成功后低劑量組和高劑量組分別灌胃5.4 g/kg和10.8 g/kg 烏參醒腦湯（灌胃前需搖勻并加熱至37℃，按照人與大鼠用藥劑量換算得出），連續(xù)灌胃21 d。對照組灌胃等體積生理鹽水，模型組按照1.3.2 方法復(fù)制模型后灌胃生理鹽水。

1.3.4 大鼠行為學(xué)觀察①曠場實(shí)驗(yàn)[9]：最后一天給藥結(jié)束后，將大鼠依次入曠場行為箱（160 cm×160 cm×50 cm 的紙箱），箱底有16 個(gè)大小一致的方格（40 cm×40 cm），利用行為學(xué)視頻分析系統(tǒng)記錄5 min 大鼠四肢爬過的方格數(shù)量，即大鼠的水平運(yùn)動(dòng)頻率。②旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)[10]：曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，于各組大鼠后頸部皮下注射0.5 mg/kg 鹽酸阿撲嗎啡，注射結(jié)束后5 min 開始計(jì)時(shí)，記錄30 min 內(nèi)大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)（360°為1 圈），即大鼠的旋轉(zhuǎn)頻率。

1.3.5 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色觀察紋狀體組織病理改變旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，待大鼠安靜，每組隨機(jī)選取4 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉大鼠，迅速取下頭部，在冰上解剖分離出腦組織紋狀體，放入10%甲醛溶液中浸泡1 周固定，石蠟包埋，切片。取石蠟切片烤干，二甲苯脫蠟處理（2 次，10 min/次），乙醇浸泡脫苯（2 次，5 min/次），蒸餾水洗凈乙醇，加蘇木精染色15 min，用0.5%鹽酸乙醇浸泡30 s，再用蒸餾水沖洗干凈，加入0.5%伊紅染色10 min，蒸餾水沖洗干凈，二甲苯浸泡透明處理（2 次，10 min/次），中性樹脂封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)元細(xì)胞呈深藍(lán)色。

1.3.6 qRT-PCR檢測紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 的表達(dá)每組隨機(jī)選取4 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，迅速取下頭部，在冰上解剖分離出腦組織紋狀體，置于2 mL 離心管，加入1 mL 裂解液，放入組織勻漿機(jī)中勻漿，勻漿后將離心管在室溫放置5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，按照Total RNA Extraction Kit 試劑盒說明書進(jìn)行后續(xù)提取，將得到的RNA 用Universal RT-PCR Kit 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR 檢測mRNA 的表達(dá)，反應(yīng)條件：95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30 個(gè)循環(huán)。以β-actin 為內(nèi)參，每個(gè)樣品做3 個(gè)復(fù)孔計(jì)算Ct 值的平均數(shù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA 相對表達(dá)量。各引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 檢測大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白的表達(dá)隨機(jī)選取每組4 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉溶液麻醉，迅速取下頭部，在冰上解剖分離出腦組織中紋狀體部分，置于2 mL 離心管中，按照動(dòng)物組織總蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，利用BCA 法測定蛋白濃度。提取結(jié)束后，利用SDS-PAGE 系統(tǒng)進(jìn)行電泳，β-actin 為內(nèi)參，轉(zhuǎn)膜，洗膜，5% BSA 蛋白封閉，一抗孵育過夜，洗膜，二抗孵育1 h，顯色液顯色，曝光分析，利用Image J 系統(tǒng)計(jì)算灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.00 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

模型組與對照組大鼠的旋轉(zhuǎn)頻率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.841，P=0.000），模型組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率較高。模型組、低劑量組、高劑量組大鼠的旋轉(zhuǎn)頻率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與模型組相比，低劑量組和高劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率降低（P＜0.05）。見表2。

對照組、模型組、低劑量組、高劑量組大鼠的水平運(yùn)動(dòng)頻率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠水平運(yùn)動(dòng)頻率降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組和高劑量組大鼠水平運(yùn)動(dòng)頻率升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組大鼠水平運(yùn)動(dòng)頻率升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率比較 （n=12，±s）

表2 各組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率比較 （n=12，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05。

水平運(yùn)動(dòng)頻率/（格/min）22.40±4.21 12.58±2.18①15.38±2.71①②19.10±3.52①②③20.923 0.000組別對照組模型組低劑量組高劑量組F 值P 值旋轉(zhuǎn)頻率/（圈/min）0.00±0.00 10.00±3.52①6.61±2.81①②3.69±1.01①②③16.850 0.000

2.2 各組大鼠紋狀體染色結(jié)果比較

各組大鼠紋狀體病理切片見圖1。對照組大鼠紋狀體多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞元形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)和輪廓清晰，且數(shù)量多。模型組大鼠紋狀體多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量很少，形態(tài)破損嚴(yán)重，多成角狀。低劑量組和高劑量組大鼠紋狀體多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多，結(jié)構(gòu)比較完整，輪廓清晰。

圖1 各組大鼠紋狀體病理切片 （HE×100）

2.3 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA相對表達(dá)量比較

對照組、模型組、低劑量組和高劑量組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，模型組PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組和高劑量組PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與低劑量組比 較，高劑 量 組PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA相對表達(dá)量比較 （n=4，±s）

表3 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA相對表達(dá)量比較 （n=4，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組高劑量組F 值P 值Bax mRNA 0.51±0.05 1.95±0.28①0.95±0.08①②0.87±0.10①②③62.619 0.000 PERK mRNA 0.55±0.04 1.07±0.18①0.71±0.11①②0.65±0.14①②③12.493 0.001 ATF4 mRNA 0.50±0.03 0.97±0.15①0.87±0.12①②0.76±0.15①②③10.870 0.001 CHOP mRNA 0.39±0.03 1.21±0.16①0.89±0.06①②0.75±0.12①②③41.516 0.000

2.4 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白相對表達(dá)量比較

對照組、模型組、低劑量組和高劑量組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：與對照組比較，模型組PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組相比，低劑量組和高劑量組PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，高劑量組PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。見表4。

表4 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白相對表達(dá)量比較 （n=4，±s）

表4 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白相對表達(dá)量比較 （n=4，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與低劑量組比較，P ＜0.05。

組別對照組模型組低劑量組高劑量組F 值P 值Bax蛋白0.56±0.06 2.01±0.35①0.98±0.09①②0.81±0.09①②③45.643 0.000 PERK蛋白0.53±0.03 1.12±0.32①0.76±0.14①②0.55±0.12①②③8.740 0.002 ATF4蛋白0.59±0.06 1.51±0.29①0.91±0.09①②0.78±0.11①②③23.413 0.000 CHOP蛋白0.41±0.05 1.39±0.20①0.95±0.08①②0.80±0.10①②③44.557 0.000

圖2 各組大鼠紋狀體PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白的表達(dá)

3 討論

PD 是以黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元變性丟失為主要特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者神經(jīng)元胞質(zhì)中出現(xiàn)易小體，且紋狀體內(nèi)多巴胺含量減少[11]。PD 一般多發(fā)于老年人，表現(xiàn)為肌肉僵直、肢體靜止性戰(zhàn)栗、運(yùn)動(dòng)遲緩并伴有步態(tài)變形等臨床癥狀，極大地影響患者生活質(zhì)量[12-13]。目前，西醫(yī)常用金剛烷胺、左旋多巴胺等藥物治療PD，但長時(shí)間服用該類藥物會(huì)導(dǎo)致患者產(chǎn)生幻覺、出現(xiàn)意識障礙、刺激腸胃、嘔吐等不良反應(yīng)，部分患者還表現(xiàn)出直立性低血壓和下肢水腫的癥狀。此外，該類藥物僅緩解PD 的癥狀，并不能達(dá)到根治的目的。藥物治療效果不佳的患者還可以選擇手術(shù)治療，即通過毀損神經(jīng)核或者進(jìn)行腦部電刺激，但該方法會(huì)產(chǎn)生不可逆損傷，且術(shù)后并發(fā)癥多，極易反復(fù)。我國中醫(yī)研究資料顯示，PD 屬實(shí)虛結(jié)合癥，實(shí)為風(fēng)、淤、痰，虛為氣血兩虛和肝腎虧虛。中藥的毒副作用少、對腸胃刺激小，因此選擇中藥方劑或許可以有效治療PD。

本研究根據(jù)藥典中收錄的“人參首烏膠囊”，另加入六味藥材配伍成烏參醒腦湯（人參、首烏、銀杏葉、黃芪、當(dāng)歸、川芎、三七、蒲黃）。其中，人參屬滋補(bǔ)藥，具有祛痰，緩解神經(jīng)衰弱的作用[14]；首烏具有益精血，補(bǔ)肝腎，祛濕痰的作用[15]；銀杏葉可活血養(yǎng)心，疏通腦絡(luò)[16]；黃芪具有益氣斂汗，補(bǔ)脾益肺的作用；當(dāng)歸為補(bǔ)血圣藥，可以補(bǔ)血活血治療血虛諸癥；川芎可活血祛瘀，行氣開郁；三七可以治氣血虛弱；蒲黃可化瘀。八味藥材相配伍，起到補(bǔ)氣、養(yǎng)血、化瘀、通腦絡(luò)的作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠運(yùn)動(dòng)遲緩，水平運(yùn)動(dòng)頻率較低，說明運(yùn)動(dòng)受阻，灌服烏參醒腦湯后，水平運(yùn)動(dòng)頻率升高，說明大鼠運(yùn)動(dòng)能力恢復(fù)；旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，低劑量和高劑量給藥組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率下降，高劑量組大鼠旋轉(zhuǎn)頻率更低，提示烏參醒腦湯可以降低帕金森病大鼠多巴胺受體敏感性，恢復(fù)大鼠運(yùn)動(dòng)障礙，且適當(dāng)增加烏參醒腦湯的劑量效果更佳。二苯乙烯苷是從首烏中提取的主要成分，大量研究顯示其對PD 動(dòng)物模型的行為具有改善作用[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元受損嚴(yán)重且數(shù)量少，低劑量組和高劑量組大鼠紋狀體內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)良好且數(shù)量較多，提示各劑量烏參醒腦湯在不同程度上對神經(jīng)元具有保護(hù)和修復(fù)的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人參的主要活性成分是人參皂堿，可以有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]；有研究顯示，二苯乙烯苷可以提高黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺含量，并且對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用[19]。三七總皂苷是三七的主要活性成分，可以誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元。以上研究與本研究結(jié)果均說明烏參醒腦湯具有保護(hù)神經(jīng)元的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種細(xì)胞的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)，適當(dāng)?shù)膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有利于細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過度則會(huì)引起相關(guān)細(xì)胞凋亡。PERK 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種跨膜蛋白激酶，介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，當(dāng)受到刺激時(shí)，PERK 被活化，進(jìn)而活化ATF4，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡活化[20]。CHOP、Bax 是參與細(xì)胞凋亡的重要因子，活化的ATF4 激活CHOP，CHOP 可以上調(diào)Bax 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠PERK、ATF4、CHOP 和Bax mRNA和蛋白相對表達(dá)量升高，說明大鼠紋狀體內(nèi)的細(xì)胞凋亡途徑已被活化，不同劑量的烏參醒腦湯給藥對PERK、ATF4、CHOP 和Bax mRNA 和蛋白有不同程度的下調(diào)作用。銀杏葉提取物具有消除自由基，減少氧化應(yīng)激的作用，抑制大鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的減少，對其有保護(hù)作用[7]；黃芪的主要活性成分是皂苷類和黃酮類化合物，可以清除體內(nèi)多余的氧自由基，具有抗氧化應(yīng)激的作用。黃捷等[22]的研究顯示，人參皂苷R3 參與調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK 通路；另有研究顯示，二苯乙烯苷和川芎嗪可以調(diào)節(jié)Bax 的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡[23-25]。以上研究結(jié)合本研究結(jié)果，說明烏參醒腦湯可以抑制PERK/ATF4 通路，從而抑制細(xì)胞凋亡

綜上所述，烏參醒腦湯具有保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元和修復(fù)已受損神經(jīng)元的作用，可以恢復(fù)帕金森病大鼠的運(yùn)動(dòng)失調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡，這可能與抑制PERK/ATF4 通路有關(guān)。