一測多評法測定混合核苷片中核糖核苷含量

李嬋，溫錦榮，劉昭，張國榮，王震△

（1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，陜西 西安 710065；2.西安萬隆制藥股份有限公司，陜西 西安 710119）

混合核苷為核糖核酸經(jīng)麥芽根浸提液在酸性條件下進行酶解所得產(chǎn)物與玉米淀粉的混合物，含胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷等多種核苷。混合核苷片是以混合核苷為主藥制成的片劑，臨床用于急慢性肝炎、肝損傷及肝硬化的輔助治療，也可用于因輻射及放射治療或化學(xué)治療引起的白細胞減少癥和非特異性血小板減少癥或白細胞減少癥［1-2］。現(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中采用紫外-可見分光光度法控制制劑中核苷混合物的總量［3］，但檢測范圍廣，在該波長處有吸收的物質(zhì)均可被檢出。在原標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上建立高效液相色譜法［4-8］，采用一測多評法實現(xiàn)多成分的質(zhì)量控制，同時解決對照品不易獲得的情況，選定合適的內(nèi)參物，根據(jù)制劑各成分間存在的線性或比例關(guān)系，建立內(nèi)參物與其他成分間的相對校正因子［9-14］，只需測定內(nèi)參物的含量，通過校正因子計算其他成分的含量。為此，本研究中建立了鳥嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷與內(nèi)參物腺嘌呤核苷的相對校正因子，通過外標(biāo)法測定腺嘌呤核苷的含量，根據(jù)腺嘌呤核苷與其他成分間的相對校正因子計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷的含量，并與外標(biāo)法測定的4種核糖核苷含量結(jié)果進行比較。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030C Plus型高效液相色譜儀、島津LC-2010CHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Waters 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；TDL-40B型臺式離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；MS105DU 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司，精度為0.1 mg）；CP225D 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器<北京>有限公司，精度為0.1 mg）。

1.2 試藥

腺苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110879-201703，純度為99.7%）；鳥苷對照品（批號為T277G005，標(biāo)定純度為0.3%），胞苷對照品（批號為R088G005，標(biāo)定純度為99.4%），均購自德國CNW Technologies GmbH 公司；尿苷對照品（Sigma -Aldrich公司，批號為BCCC2099，標(biāo)定純度為100.0%）；混合核苷片（西安萬隆制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20057365，批號分別為181206，181207，181208，181209，181210，181211，200902，201001，201002，201003）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：迪馬Platisil ODS 柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；流動相：30%甲醇（A）-5%甲醇（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。在此色譜條件下混合對照品溶液胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷保留時間的RSD分別為0.03%，0.08%，0.11%，0.05%，峰面積的RSD分別為0.06%，0.05%，0.09%，0.19%。4 種核苷保留時間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD均小于2.0%，表明系統(tǒng)適用性試驗結(jié)果符合要求。胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的理論板數(shù)分別為8 192，10 698，15 208，144 254；分離度分別為7.128，19.965，26.910。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase（%）

2.2 溶液制備

供試品溶液：取樣品20片，研細，取細粉適量（約相當(dāng)于核苷混合物0.16 g），精密稱定，置100 mL 容量瓶中，加水適量，超聲處理10 min 使提取完全，用水稀釋并定容，搖勻，離心（轉(zhuǎn)速為3 500 r/ min）10 min，精密量取上清液5.0 mL，置50 mL容量瓶中，用水釋，搖勻并定容，0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

混合對照品溶液：取胞嘧啶核苷對照品15 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加水使溶解并定容，搖勻，作為胞嘧啶核苷對照品母液（質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL）。分別取尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷對照品11.5 mg，精密稱定，分別置25 mL 容量瓶中，加水使溶解并定容，搖勻，作為尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷對照品母液（質(zhì)量濃度均為0.46 mg/mL）。分別精密量取上述4 種核苷對照品母液各1.0 mL，置50 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：按處方比例制備不含混合核苷的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備相應(yīng)的陰性對照品溶液。

對照品定位溶液：精密量取上述4種核苷對照品母液各1.0 mL，分別置50 mL容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：取2.2 項下陰性對照品溶液、對照品定位溶液、混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，結(jié)果各成分與相鄰組分分離較好。色譜圖見圖1。

線性關(guān)系考察、檢測限與定量限確定：分別精密量取2.2 項下核苷對照品母液1.0 mL，置25 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，作為線性溶液6；分別精密量取上述溶液1，2，3，5，8 mL，置10 mL 容量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，分別作為線性溶液1-5。按2.1項下色譜條件進樣測定，以胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程，詳見表2。取2.2項下對照品溶液，逐級稀釋，以信噪比分別為10∶1和3∶1 的質(zhì)量濃度計算定量限和檢測限。按2.1 項下色譜條件進樣測定。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察、定量限與檢測限確定結(jié)果Tab.2 Results of the linear relation test，LOQ and LOD

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為201001）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液6份，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的平均含量分別為2.30%，6.03%，6.62%，9.10%，RSD分別為1.40%，0.63%，0.88%，0.44%（n=5），表明方法重復(fù)性良好。

精密度試驗：取重復(fù)性試驗項下供試品溶液6份，按2.1 項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的含量，平均含量分別為2.28%，6.12%，6.58%，9.01%，RSD分別為1.80%，1.60%，0.92%，1.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，按2.1 項下色譜條件分別于0，2，5，9，12 h 時進樣測定，記錄各成分的峰面積，計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷峰面積的RSD分別為1.6%，0.58%，0.79%，0.50%（n=5），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：取胞嘧啶核苷對照品30 mg、鳥嘌呤核苷對照品75 mg、尿嘧啶核苷對照品75 mg、腺嘌呤核苷對照品115 mg，精密稱定，分別置100 mL容量瓶中，加水溶解、稀釋并定容，搖勻，作為各個成分的回收率對照品母液。取樣品（批號為201001）細粉適量（約相當(dāng)于核苷混合物0.08 g），精密稱定，分別加入上述回收率對照品母液4，5，6 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄各成分的峰面積。計算得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的回收率分別為99.4%，99.1%，100.5%，99.9%，RSD分別為0.83%、0.28%，0.81%，0.63%（n=9），表明結(jié)果準(zhǔn)確度良好。

耐用性試驗：取2.2項下混合對照品溶液與供試品溶液，按2.1 項下色譜條件采用不同色譜儀、色譜柱進行檢測，記錄各成分的峰面積，按外標(biāo)法以峰面積計算胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的標(biāo)示含量。與2.1 項下色譜條件比較，不同色譜儀和色譜柱所得胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷的標(biāo)示含量的變化率分別為1.20%，0.25%，1.50%，0.23%，4 種成分標(biāo)示含量總和的變化率為0.83%，均小于2.0%，表明方法耐用性良好。

2.4 相對校正因子（fs/i）

fs/i的建立：根據(jù)公式fs/i=（As×Ci）/（Ai×Cs）計算一測多評的fs/i［14］。式中，As代表內(nèi)參物腺嘌呤核苷峰面積，Cs代表內(nèi)參物腺嘌呤核苷質(zhì)量濃度，Ai代表其他組分峰面積，Ci代表其他組分濃度。以腺嘌呤核苷為內(nèi)參物，計算腺嘌呤核苷與胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷的fs/i分別為1.84，1.40，1.25，RSD分別為0.22%，1.75%，0.41%。結(jié)果見表3。

表3 胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷與腺嘌呤核苷的相對校正因子Tab.3 RCFs of cytidine，uridine and guanosine relative to adenosine

不同高效液相色譜系統(tǒng)和色譜柱對fs/i的影響：分別用Waters 2695、島津LC -2030C Plus 2 種高效液相色譜系統(tǒng)進行試驗，考察了迪馬Platisil ODS 色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）和InertsilTMODS -3 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）對fs/i的影響，各成分在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱上fs/i的RSD均小于5.0%［15］。詳見表4。

表4 不同色譜儀和色譜柱對相對校正因子的影響Tab.4 Effects of different chromatographs and chromatographic columns on the RCFs

2.5 一測多評法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較

取10 批樣品，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定，測定各成分的峰面積。以腺嘌呤核苷為內(nèi)參物，計算腺嘌呤核苷與其他3種成分的fs/i，并通過fs/i計算各自的標(biāo)示含量。以外標(biāo)法計算4 種成分的標(biāo)示含量，并對比2 種方法所測得結(jié)果的差異。結(jié)果見表5。外標(biāo)法與一測多評法所測得結(jié)果的RSD均小于5.0%，差異無顯著性，表明一測多評法可用于混合核苷片中多種成分含量的測定。

表5 外標(biāo)法與一測多評法測定結(jié)果比較（%）Tab.5 Comparison of content determination of four components in Mixed Nucleoside Tablets by the ESM and the QAMS（%）

3 討論

混合核苷片中主要有效成分為胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鳥嘌呤核苷、腺嘌呤核苷等，其中腺嘌呤核苷對照品易得，性質(zhì)較穩(wěn)定。故選擇腺嘌呤核苷為內(nèi)參物?；旌虾塑掌续B嘌呤核苷、腺嘌呤核苷、尿嘧啶核苷、胞嘧啶核苷均易溶于水。水作提取溶劑具有干擾小、不污染環(huán)境等優(yōu)點［16］。故選擇水提法。本研究中，供試品溶液于200～400 nm 波長范圍進行紫外掃描，于257.8 nm 波長處有最大紫外吸收，且空白輔料溶液在此范圍內(nèi)無紫外吸收。參考現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中含量測定方法，選擇260 nm作為最終吸收波長。

綜上所述，一測多評法可用于測定混合核苷片中多種成分的含量，可為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究提供參考。