宏基因二代測序技術(shù)輔助診斷恙蟲病腦膜炎1例報(bào)告

陳兆宇， 曾 瓊， 魏麗玲， 官遠(yuǎn)林

恙蟲病又稱叢林斑疹傷寒，是一種自然疫源性的急性發(fā)熱性疾病，由恙蟲立克次體感染引起。其主要癥狀為發(fā)熱、叮咬處焦痂、局部淋巴結(jié)腫大及皮疹。該病可累及全身各系統(tǒng)，包括肺、肝、心臟[1]等。當(dāng)其累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)時(shí)，除了以上臨床癥狀外，還會出現(xiàn)頭痛、嘔吐、頸項(xiàng)強(qiáng)直甚至意識障礙等表現(xiàn)，與病毒性腦膜炎等CNS感染性疾病難以鑒別。宏基因二代測序(metagenomic next generation sequencing，mNGS)是一種高通量測序技術(shù)，可快速、準(zhǔn)確而全面地檢測標(biāo)本中各種微生物，在感染性疾病的診斷方面擁有著巨大的潛力[2]。目前有關(guān)mNGS在恙蟲病腦膜炎診斷價(jià)值方面的報(bào)道仍較少。本文報(bào)告1例因發(fā)熱、頭痛入院的患者，未見典型焦痂等表現(xiàn)，腦脊液病原學(xué)檢查及頭部MR亦無明顯異常，經(jīng)抗病毒、抗感染等治療均無效，最終使用mNGS技術(shù)檢測到腦脊液中恙蟲東方體確診，及時(shí)換用多西環(huán)素治療后病情得到緩解。

1 臨床資料

患者，男性，50歲，采茶場農(nóng)民。因“頭痛4 d，發(fā)熱1 d” 于2020年11月8日收入汕大附一醫(yī)院?；颊?1月4日無明顯誘因開始出現(xiàn)全頭部持續(xù)性脹痛，伴惡心，無嘔吐，間斷干咳，無乏力、咽痛，無頭暈，無畏寒發(fā)熱等，遂到當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診，完善頭部CT提示左側(cè)基底節(jié)區(qū)腔隙性腦梗死(未見報(bào)告)。期間頭痛癥狀逐漸加重，11月7日早晨開始出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高39.3 ℃，予抗感染、止痛等治療后無明顯好轉(zhuǎn)。遂為進(jìn)一步治療于11月8日擬“頭痛、發(fā)熱查因：顱內(nèi)感染？”轉(zhuǎn)到我院。既往史及家族史無特殊。個(gè)人史：無外地久居史，工作原因每日均需到山林茶場中，否認(rèn)煙酒史。入院查體：體溫37.4 ℃，血壓 138/64 mmHg，心率80次/min，呼吸20次/min。神志清楚，精神疲，心肺腹查體未見明顯異常。神經(jīng)系統(tǒng)查體：記憶力、理解力、定向力正常，言語清晰，對答切題，雙側(cè)額紋對稱，雙側(cè)瞳孔等圓等大，直徑約2.5 mm，對光反射靈敏，雙眼球各向運(yùn)動(dòng)無受限，無眼震，雙側(cè)鼻唇溝對稱，伸舌居中。頸軟無抵抗，頦胸距2橫指，雙側(cè)克氏征(-)，四肢肢體肌力V級，肌張力正常。雙側(cè)病理征(-)。感覺系統(tǒng)、共濟(jì)運(yùn)動(dòng)檢查無異常。輔助檢查：血常規(guī)提示白細(xì)胞10.02×109/L、嗜中性粒細(xì)胞比例66.37%，生化提示羥丁酸脫氫338.21 U/L、乳酸脫氫酶597 U/L、谷草轉(zhuǎn)氨酶112.27 U/L，谷丙轉(zhuǎn)氨酶79.17 U/L、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶266.26 U/L、總膽紅素28.85 μmol/L、直接膽紅素12.12 μmol/L、間接膽紅素16.73 μmol/L，血沉21 mm/h，C反應(yīng)蛋白71.10 mg/L，降鈣素原1.47 ng/ml。病原學(xué)檢查：HIV抗體、乙肝表面抗原、梅毒螺旋體抗體、肺炎支原體IgM抗體、外斐試驗(yàn)、肥達(dá)試驗(yàn)均陰性，結(jié)核桿菌抗體測定弱陽性，血培養(yǎng)未見異常。胸部CT：雙肺散在絮片、條片密度增高模糊影，雙肺下葉為主。結(jié)論：雙肺炎癥。頭部MR平掃+MRA+MRV：雙側(cè)額葉白質(zhì)區(qū)散在小點(diǎn)狀缺血灶(見圖1)。

MRA示輕度腦動(dòng)脈硬化，MRV未見異常。腦電圖：兩側(cè)以枕區(qū)大致對稱10～11c/s，10～30 uV α波為主節(jié)律，波形及調(diào)節(jié)欠佳，間斷有略多低電壓β活動(dòng)；各導(dǎo)聯(lián)可見較多彌散性最高波幅達(dá)38uV θ波、θ活動(dòng)。O-C：α波大部分抑制。Hv及閃光刺激：仍見較多彌散性最高波幅達(dá)47 uV θ波、θ活動(dòng)及數(shù)個(gè)δ波；結(jié)論：輕-中度不正常腦電圖。初步診斷為：顱內(nèi)感染；肺炎；肝功能不全。入院后予哌拉西林舒巴坦鈉(3 g/次，每8 h 1次)抗感染治療，以及退熱、護(hù)肝、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等對癥支持治療。住院期間患者仍反復(fù)發(fā)熱，每日熱峰間于39.0 ℃～39.6 ℃，頭痛程度漸進(jìn)性加重，仍有惡心，無嘔吐，同時(shí)開始出現(xiàn)上腹部脹痛不適，伴納差，零星咳嗽、痰少。11月10日早晨開始出現(xiàn)胸背部散在大小不等淡紅色風(fēng)團(tuán)樣皮疹，伴輕度瘙癢。查體示出現(xiàn)輕度頸抵抗，頦胸距3橫指，右側(cè)克氏征(+)，左側(cè)克氏征可疑(+)，予加用脫水降顱壓治療(甘露醇20% 125 ml/次，1 d 2次)。為進(jìn)一步明確病因，分別于11月10日、11月13日行腰椎穿刺術(shù)，取腦脊液行常規(guī)、生化、免疫生化、細(xì)菌及真菌培養(yǎng)等檢查結(jié)果(見表1)。

另留取標(biāo)本2 ml外送行腦脊液mNGS。兩次腰穿測得顱內(nèi)壓明顯升高，腦脊液均呈無色透明狀，常規(guī)、生化結(jié)果提示有核細(xì)胞數(shù)、蛋白輕度升高，糖和氯化物含量正常，與病毒感染相關(guān)腦脊液改變類似。綜合患者急性起病過程，發(fā)熱、頭痛和頸項(xiàng)強(qiáng)直等表現(xiàn)，以及頭部MR平掃結(jié)果，考慮為病毒性腦膜炎可能。遂于11月13日加用更昔洛韋(0.3g/次，每12 h 1次)抗病毒治療。期間查房時(shí)發(fā)現(xiàn)患者右胸上外側(cè)近肩關(guān)節(jié)處有一大小約7 mm×7 mm暗褐色皮損，其上曾有結(jié)痂痕跡，痂皮基本已脫落(見圖2)。

結(jié)合患者長期頻繁野外作業(yè)史及癥狀特點(diǎn)，考慮此皮損可能為焦痂脫落后的痕跡，疑診恙蟲病。11月15日腦脊液mNGS回報(bào)示：恙蟲病東方體，特異性序列數(shù)76，基因組覆蓋度39565bp/0.2549%，其基因組核苷酸分布序列等結(jié)果(見圖3)。

最終明確診斷為：恙蟲病腦膜炎，合并恙蟲病相關(guān)肝功能損害及肺炎。立即停用更昔洛韋，改用多西環(huán)素(100 mg/次，每日2次)口服，其余繼續(xù)護(hù)肝、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等對癥支持治療。11月16日后患者未再發(fā)熱，胸背部皮疹逐漸消退，無遺留色素沉著、瘢痕等。此后頭痛癥狀逐漸好轉(zhuǎn)，上腹部不適及咳嗽、咳痰等癥狀均有不同程度改善。11月20日再次行腰椎穿刺術(shù)檢查，測得顱內(nèi)壓恢復(fù)正常，但腦脊液檢查結(jié)果仍提示有核細(xì)胞數(shù)及蛋白輕度升高(見表1)。11月24日復(fù)查頭部MR未見異常，此時(shí)患者頭痛及上腹部不適癥狀已基本緩解，仍有零星咳嗽，精神狀態(tài)明顯改善，查體示腦膜刺激征轉(zhuǎn)陰?；颊呒凹覍倬芙^繼續(xù)住院治療要求出院，予簽字辦理自動(dòng)出院，出院后未再復(fù)診。

表1 患者腦脊液檢查結(jié)果

2 討 論

恙蟲病是一種自然疫源性的急性發(fā)熱性疾病，病原體為恙蟲病立克次體，以鼠類等嚙齒動(dòng)物為中間貯存宿主，通過恙螨幼蟲進(jìn)行傳播。起病急，臨床表現(xiàn)有高熱、頭痛、全身酸痛乏力、皮疹、淋巴結(jié)腫大及皮膚焦痂等。癥狀多不典型，僅有約一半原發(fā)感染者和小部分繼發(fā)感染者會在恙螨叮咬處形成無痛性焦痂，常于身體隱匿處(如：腋窩、會陰)較難被發(fā)現(xiàn)[1]。恙蟲病病理表現(xiàn)為小血管炎及血管周圍炎，可累及全身各系統(tǒng)，表現(xiàn)為肝功能損害[3]、肺部感染[4]、急性呼吸窘迫綜合征及CNS損害等。當(dāng)CNS受累時(shí)常發(fā)生腦膜炎或腦膜腦炎，少見的有外展神經(jīng)麻痹、急性橫貫性脊髓炎等[5]，常見癥狀有頭痛、嘔吐及意識障礙，體征表現(xiàn)為腦膜刺激征陽性。發(fā)病機(jī)制現(xiàn)尚未明確，Bohacsova的研究表明立克次體可引起神經(jīng)元形態(tài)學(xué)退化和細(xì)胞內(nèi)ATP的減少[6]，而另一項(xiàng)動(dòng)物試驗(yàn)則提示立克次體可能是通過引起CNS炎癥反應(yīng)致病的[7]。恙蟲病CNS感染尚無公認(rèn)診斷標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)滿足恙蟲病診斷條件，出現(xiàn)CNS受累癥狀、體征，腦脊液正?；虺逝c病毒感染類似的改變，頭部影像學(xué)檢查伴或不伴異常[8]時(shí)，再除外其他原因所致的CNS損害后，可考慮診斷。診斷恙蟲病除了依靠流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)外，實(shí)驗(yàn)室檢查也是重要的一部分，其中包括血清學(xué)和分子生物學(xué)兩類。血清學(xué)檢查有外斐試驗(yàn)、間接免疫熒光分析法(indirect immunofluorescent assay，IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)等[9]。臨床上應(yīng)用較多的是外斐試驗(yàn)，價(jià)格便宜、操作簡單，但常因患者機(jī)體未能產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答、免疫功能低下等因素出現(xiàn)假陰性，起病1 w內(nèi)陽性率低[10]。我院并未開展變形桿菌屬XK菌株的O抗原凝集試驗(yàn)，因此本例外斐試驗(yàn)陰性。IFA被認(rèn)為是診斷恙蟲病的金標(biāo)準(zhǔn)[11]，但費(fèi)用昂貴、操作復(fù)雜、周期較長、檢驗(yàn)結(jié)果缺乏客觀性等[12]因素使其并未廣泛開展。

分子生物學(xué)檢測方法包括PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop mediated isothermal amplification，LAMP)法、及宏基因組二代測序(metagenomic next generation sequencing，mNGS)等[12]，本文病例即選用mNGS協(xié)助診斷。mNGS全稱為宏基因二代測序技術(shù)，該方法通過提取腦脊液、血液等標(biāo)本所有微生物的總DNA，基于Illumina、BGI、Oxford Nanopore、PacBio等平臺進(jìn)行文庫構(gòu)建，上機(jī)檢測標(biāo)本所有核酸序列后在基因組參考數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行微生物比對、鑒定，最終確定責(zé)任微生物。與傳統(tǒng)病原學(xué)檢查方法對比，優(yōu)點(diǎn)在于：(1)無針對性，直接檢測標(biāo)本中所有微生物核酸序列，并能根據(jù)特異性序列數(shù)對微生物進(jìn)行定量或半定量化，對各種已知、未知病原體的檢測都具參考意義;(2)不易受抗生素治療、微生物生長條件、患者免疫功能等因素影響;(3)需時(shí)短，最快可于48 h內(nèi)完成[13];(4)可提供菌株比對鑒定、耐藥性預(yù)測及毒力分析等輔助基因組信息。

該例患者以發(fā)熱、頭痛為首發(fā)癥狀，后續(xù)出現(xiàn)皮疹及消化、呼吸道癥狀等全身各系統(tǒng)受累表現(xiàn)，腦脊液檢查僅提示顱壓升高，常規(guī)生化示病毒感染樣非化膿性改變，其余檢查無陽性發(fā)現(xiàn)，初步診斷為病毒性腦膜炎。但經(jīng)抗病毒等治療后病情卻未見好轉(zhuǎn)。后腦脊液mNGS回報(bào)恙蟲病東方體，檢出特異性序列數(shù)76，綜合測序量、病原體基因組大小、質(zhì)控分析等維度，同時(shí)結(jié)合患者職業(yè)特點(diǎn)，癥狀及可疑焦痂皮損、顱高壓體征，并除外其他原因所致的CNS損害后，確診為恙蟲病腦膜炎。病程中患者并未發(fā)現(xiàn)典型焦痂等特異性表現(xiàn)，依靠臨床常用檢驗(yàn)及影像學(xué)方法亦難與病毒性腦膜炎相鑒別，蘇鳳新等人的研究也報(bào)道了恙蟲病易被誤診為病毒性腦膜炎這一情況[14]。若延誤治療時(shí)機(jī)，病情可能繼續(xù)進(jìn)展，甚至發(fā)生全身多器官功能衰竭、彌散性血管內(nèi)凝血等[15]情況。最終該患者通過mNGS完成診斷，及時(shí)獲得有效治療。

在CNS感染方面，mNGS對常見細(xì)菌、病毒的檢測比傳統(tǒng)方法陽性率更高[16]，而其對如熱帶念珠菌、狒狒巴拉姆希阿米巴等罕見或新發(fā)病原體的檢測方面則更有價(jià)值，能顯著提高確診概率[17]。mNGS檢出特異性序列數(shù)也存在參考價(jià)值，例如對于DNA病毒性腦膜炎/腦炎，檢出序列數(shù)越高對診斷意義越大[18]。但在對mNGS應(yīng)用過程中，仍發(fā)現(xiàn)其不足之處：(1)費(fèi)用昂貴，難以通過復(fù)查監(jiān)測感染變化情況;(2)需及時(shí)取材，標(biāo)本保存時(shí)間過長或經(jīng)歷多次凍融循環(huán)可能降低診斷效能;(3)標(biāo)本污染、背景微生物的存在會影響結(jié)果判讀;(4)基因組比對、質(zhì)控等過程中可能出現(xiàn)數(shù)據(jù)分析誤差;(5)檢測結(jié)果并無絕對意義，特別對于檢出序列數(shù)較低的樣本，需結(jié)合臨床情況判讀。

綜上所述，恙蟲病累及CNS發(fā)生腦膜炎時(shí)，以發(fā)熱、頭痛為主要癥狀，并可出現(xiàn)腦膜刺激征陽性，腦脊液檢查正?；虺什《靖腥緲臃腔撔愿淖?，頭部影像學(xué)檢查可無特異性改變。當(dāng)未見典型焦痂皮損，而病原學(xué)檢查又無陽性發(fā)現(xiàn)時(shí)，非?？漆t(yī)師可能因忽視患者工作特點(diǎn)、或?qū)οx病等感染性疾病認(rèn)識不充分等因素，將其誤診為病毒性腦膜炎，從而延誤治療時(shí)機(jī)。在臨床工作中，通過常規(guī)方法未能查明感染情況時(shí)，應(yīng)合理應(yīng)用mNGS協(xié)助明確診斷，才能及時(shí)制定針對性的臨床決策，改善患者預(yù)后。