黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)蘭州百合采后病害的防治效果

令利軍，程文婷，蔣坤玲，王圓圓，羅 鴻，楊彩云，龐明梅，馬穩(wěn)霞

(西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn)是菊科蒿屬一年生草本植物，其葉、嫩枝、花蕾含有多種藥用成分，具有抗菌、抗寄生蟲、解熱以及增強(qiáng)免疫等作用[1]。通過水蒸氣蒸餾法獲得的黃花蒿精油(essential oil ofArtemisiaannua,ALEO)具有抗蟲活性，對(duì)害蟲體內(nèi)支持生命的生物分子具有強(qiáng)抑制作用，同時(shí)具有較強(qiáng)的抗菌及抗氧化活性[2]。桉葉油醇(1,8-cineole)是黃花蒿精油的主要成分之一，具有抗炎和抗氧化作用[3]。

蘭州百合是國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[4]，具有清肺功效，其鱗片中富含淀粉、蔗糖、氨基酸等重要營(yíng)養(yǎng)成分，具有促進(jìn)胃腸功能、降低血糖、調(diào)節(jié)血脂等作用，被譽(yù)為“蔬菜人參”[5]。百合在采摘、貯藏、運(yùn)輸?shù)冗^程中容易受到機(jī)械損傷，致病菌從其肉質(zhì)根或鱗莖上的傷口侵入，從而造成鱗莖褐變腐爛[6]。真菌感染是蘭州百合在貯藏過程中安全性及感官特性改變、功能物質(zhì)被破壞及產(chǎn)生異味的主要原因，導(dǎo)致食用價(jià)值下降[7-8]。目前，多種植物精油進(jìn)入果蔬保鮮領(lǐng)域。 Louise等[9]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬香茅(Cymbopogoncitratus(D.C) Stapf)精油通過抑制番石榴中不同炭疽菌的生長(zhǎng)和繁殖抑制炭疽病發(fā)展，減少番石榴質(zhì)量、硬度和顏色變化，并有助于提高感官參數(shù)的酶活性，延緩番石榴成熟，提升果實(shí)采后品質(zhì)且延長(zhǎng)貨架期；猴面包樹莖葉精油具有抑菌作用和保持番茄果實(shí)貯藏品質(zhì)的潛力[10]；大蒜和迷迭香精油在實(shí)驗(yàn)室和溫室條件下具有較好的殺菌效果，能顯著降低草莓果實(shí)炭疽病的發(fā)病率和腐爛程度，并且保留了草莓果實(shí)的感官屬性和品質(zhì)參數(shù)[11]。已有研究表明蒿屬植物精油具有廣譜抑菌活性[12]，但關(guān)于蒿屬植物精油用于蘭州百合采后保鮮的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究探討了黃花蒿精油及其單體桉葉油醇(1,8-cineole)對(duì)蘭州百合采后病原菌的抑菌作用，并檢測(cè)其濃度對(duì)蘭州百合采后病害的防治效果，測(cè)定最佳保鮮濃度的黃花蒿精油及其單體處理后對(duì)蘭州百合主要品質(zhì)指標(biāo)及生理生化指標(biāo)的影響，從而篩選出適宜蘭州百合保鮮的劑量，以期為黃花蒿精油及其單體在蘭州百合采后保鮮中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黃花蒿(ArtemisiaannuaLinn)于2019年采自甘肅省蘭州市(35°55′53″ N，102°54′04″ E，海拔2 200 m)，采用水蒸氣蒸餾法提取黃花蒿精油，用正己烷萃取餾出物并收集精油，用無水硫酸鈉干燥，密封于玻璃瓶中,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。黃花蒿精油(純度100%)及其單體桉葉油醇均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%吐溫-80稀釋。

新鮮蘭州百合由蘭州市七里河區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站提供，低溫貯藏。

病原細(xì)菌摩加夫芽孢桿菌(Bacillusmojavensis)MT434775(B-6)，病原真菌李氏木霉(Trichodermalixii)MT434003(F-2)、籃狀菌(Talaromycestumuli)MT434005(F-3)、鐮刀菌(Fusariumannulatum)MT434004(F-6)，前期研究發(fā)現(xiàn)以上病原菌皆為蘭州百合采后病害的主要致病菌[13]，均由西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物與微生物互作實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器設(shè)備

BSC-1300ⅡA2 生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ULTRA Plus掃描電子顯微鏡，德國(guó)蔡司有限責(zé)任公司；U2800紫外分光光度計(jì)，上海昂拉儀器有限公司。

1.3 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇的抑菌活性

1.3.1 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定 采用倍比稀釋法[14]測(cè)定黃花蒿精油及其單體的MIC及MBC。將活化至對(duì)數(shù)期的病原細(xì)菌B-6調(diào)節(jié)至106CFU/mL ，取500 μL菌懸液至500 μL黃花蒿精油及其單體桉葉油醇濃度分別為2.5，5，10，20 mL/L的LB液體培養(yǎng)基中，使得黃花蒿精油及其單體桉葉油醇最終濃度分別為1.25，2.5，5，10 mL/L，以等量無菌水為對(duì)照。確定無明顯細(xì)菌增長(zhǎng)的黃花蒿精油及其單體的最低濃度為MIC，此濃度下具有不可見(無濁度)的細(xì)菌生長(zhǎng)。 確定初始接種細(xì)菌被全部殺死的黃花蒿精油及其單體的最低濃度為MBC。

1.3.2 毒力分析 采用熏蒸法[15]測(cè)定黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)3種病原真菌的毒力。用無菌打孔器取病原真菌菌餅置于新鮮的PDA固體培養(yǎng)基中央，將不同濃度 (0.02，0.06，0.10，0.14，0.18，0.22，0.28，0.34，0.40 和 0.46 mL/L)黃花蒿精油及不同濃度桉葉油醇(0.02，0.06，0.10，0.14，0.18，0.30，0.40 和 0.60 mL/L)分別添加到無菌濾紙片(d=6 mm)上，然后將無菌濾紙片置于玻璃皿蓋子中央，以無菌水為對(duì)照，放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑制率。通過SPSS分析建立以藥物濃度對(duì)數(shù)為自變量(y)，抑制率值為因變量(x)的毒力回歸方程(y=ax+b)、相關(guān)系數(shù)、95%置信區(qū)間和EC50,并以EC50表示黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制作用的強(qiáng)弱。

抑菌率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.4 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原菌細(xì)胞壁的影響

1.4.1 病原細(xì)菌 參考謝家儀等[16]的方法并稍作修改。離心收集活化的B-6菌種，用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)重懸，再用黃花蒿精油及桉葉油醇的MIC、MBC濃度處理菌體 4 h，將處理的菌懸液8 000 r/min離心5 min，棄上清，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛固定4 h，PBS清洗3次,最后用乙醇(體積分?jǐn)?shù)30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)梯度脫水，收集菌體于濾紙包中冷凍干燥，將干燥好的樣品鍍金鏡檢。以等量無菌水處理為對(duì)照。

1.4.2 病原真菌 用無菌打孔器取病原真菌F-2、F-3和F-6菌餅分別接種于無菌PDA培養(yǎng)基上，用EC50濃度的黃花蒿精油及桉葉油醇分別處理病原真菌，以等量無菌水為對(duì)照。黃花蒿精油對(duì)病原真菌F-2、F-3和F-6的EC50分別為0.314，0.336，0.357 mL/L，桉葉油醇對(duì)病原真菌F-2、F-3和F-6的EC50分別為0.280，0.289，0.420 mL/L。將不同濃度的黃花蒿精油及桉葉油醇分別添加到無菌濾紙片(d=6 mm)上，然后將濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋子中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長(zhǎng)出菌絲，用無菌手術(shù)刀切取菌落邊緣的菌絲，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的戊二醛中固定過夜，0.2 mol/L PBS(pH 7.2)沖洗2次后，用乙醇(體積分?jǐn)?shù)30%，50%，70%，80%，90%，95%，100%)梯度脫水，每個(gè)梯度脫水 15 min，冷凍干燥好的樣品鍍金鏡檢[17]。

1.5 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)蘭州百合采后病害的防治

取新鮮蘭州百合鱗片，自來水沖洗后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇表面消毒20～30 s，無菌水洗滌2～3次，用無菌手術(shù)刀將百合切成1.5 cm×1.5 cm的小塊，并用手術(shù)刀致傷，每個(gè)傷點(diǎn)加10 μL(106CFU/mL)病原細(xì)菌懸浮液或病原真菌孢子懸浮液，置于直徑90 mm培養(yǎng)皿中。以致傷只加病原菌為對(duì)照，將15.38， 30.77， 46.15和61.53 μL/L的黃花蒿精油及其單體桉葉油醇吸附至直徑6 mm無菌濾紙片上，將濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋子中央，密封后在25 ℃保持9 d，拍照并用image J軟件計(jì)算病斑面積，篩選黃花蒿精油及其單體桉葉油醇的最佳保鮮濃度。

1.6 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)蘭州百合采后生理生化指標(biāo)的影響

蘭州百合處理同1.5節(jié)，以病原真菌F-6為防治對(duì)象對(duì)蘭州百合進(jìn)行接種處理，試驗(yàn)組培養(yǎng)皿中分別加入15.38 μL/L的黃花蒿精油和桉葉油醇，對(duì)照組(CK)加入清水處理。密封后在25 ℃保持9 d，分別在保持0，3，6和9 d時(shí)測(cè)定蘭州百合的品質(zhì)指標(biāo)及生理生化指標(biāo)。

1.6.1 自由基清除率和褐變度 蘭州百合褐變度測(cè)定參考程雙[18]的方法，其褐變度以10×OD420表示。取500 μL蘭州百合上清液與2 mL 60 μmmol/L DPPH乙醇溶液混合，避光室溫放置30 min后，在517 nm處測(cè)量樣品的吸光度值，以DPPH乙醇溶液為陰性對(duì)照，計(jì)算DPPH清除率。試驗(yàn)重復(fù)3次。

自由基清除率=[(A0-A1)/A0]×100%。

式中：A0為DPPH乙醇溶液的吸光度值，A1為樣品溶液的吸光度值。

1.6.2 總酚和類黃酮含量測(cè)定 總酚和類黃酮含量測(cè)定參考Chen等[19]的方法，總酚含量以10×OD280表示，類黃酮含量以10×OD325表示。

1.6.3 可溶性糖含量測(cè)定 可溶性糖含量測(cè)定采用蒽酮硫酸法[18]。

1.6.4 丙二醛(MDA)含量測(cè)定 MDA含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改：將蘭州百合分別用15.38 μL/L的黃花蒿精油和桉葉油醇處理3 d，取蘭州百合鱗片1.0 g，加入10%三氯乙酸(TCA)5 mL勻漿，10 000g離心30 min,得到5 mL提取液。取2 mL提取液添加到2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(TBA)中，在沸水中煮沸20 min，冷卻至室溫后吸取0.6 mL在450，532和600 nm處測(cè)其吸光度值。根據(jù)以下公式計(jì)算MDA含量。

c(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450；

MDA含量(μmol/g)=(c×V)/(Vs×m×1 000)。

式中：c為蘭州百合組織提取液中MDA濃度，μmol/L；V為樣品提取液總體積，mL；Vs為測(cè)定時(shí)所需樣品提取液的體積,mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.6.5 保護(hù)酶活性測(cè)定 取5 g蘭州百合鱗片至5 mL提取緩沖液中，4 ℃、12 000g離心30 min，收集上清液用于測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性。SOD活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[21]的方法，POD和PPO活性測(cè)定采用Habibi等[22]的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 20.0軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用Origin 2018繪圖，采用Duncan’s檢驗(yàn)差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇的抑菌活性

2.1.1 對(duì)病原細(xì)菌的MIC及MBC 采用倍比稀釋法測(cè)定黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原細(xì)菌摩加夫芽孢桿菌MT434775(B-6)的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)，結(jié)果表明，黃花蒿精油和桉葉油醇對(duì)B-6的MIC值均為1.25 mL/L,MBC值分別為1.25和5.00 mL/L，說明黃花蒿精油對(duì)B-6的抑菌作用較桉葉油醇強(qiáng)。

2.1.2 對(duì)病原真菌的毒力 采用熏蒸法測(cè)定黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)3種供試病原真菌的抑菌作用，通過SPSS 20.0軟件分析其對(duì)3種病原真菌的毒力大小，結(jié)果如表1所示。由表1可知，黃花蒿精油對(duì)F-2、F-3、F-6的EC50分別為0.314，0.336和0.357 mL/L，桉葉油醇對(duì) F-2、F-3、F-6的EC50分別為0.280，0.289和0.420 mL/L，表明桉葉油醇對(duì)蘭州百合病原真菌F-2和F-3具有較好的抑菌效果，黃花蒿精油對(duì)F-6的抑菌效果較好。

表1 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原真菌的毒力

2.2 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原菌細(xì)胞壁的影響

2.2.1 對(duì)病原細(xì)菌細(xì)胞壁的影響 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原細(xì)菌B-6細(xì)胞壁的影響如圖1所示。由圖1可知，對(duì)照處理病原細(xì)菌B-6細(xì)胞菌體完整，呈典型的桿狀，表面光潔平整，無菌體內(nèi)容物外滲。用MIC、MBC濃度的黃花蒿精油和桉葉油醇處理4 h后，病原細(xì)菌B-6單個(gè)菌體不再完整，大量菌體出現(xiàn)堆積，表面出現(xiàn)褶皺，內(nèi)容物滲出，細(xì)胞無充盈感，菌體拉長(zhǎng)甚至斷裂；黃花蒿精油和桉葉油醇濃度越大，對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁影響越大。

CK.對(duì)照處理；MIC.最小抑菌濃度處理；MBC.最小殺菌濃度處理

2.2.2 對(duì)病原真菌細(xì)胞壁的影響 通過掃描電鏡觀察黃花蒿精油及其單體桉葉油醇處理后病原真菌菌絲形態(tài)的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)病原真菌細(xì)胞壁的影響(×3 000)

由圖2可以看出，對(duì)照組病原真菌菌絲為均勻而規(guī)則的管狀；將病原真菌接種后暴露于黃花蒿精油和桉葉油醇的EC50濃度中，菌絲表面出現(xiàn)大量褶皺、斷裂、扭曲、末端膨大，菌絲變粗呈不規(guī)則狀，大量出芽產(chǎn)生孢子，其中桉葉油醇處理病原真菌菌體皺縮更明顯。

2.3 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)蘭州百合采后病害的防治

由表2可知，接種病原菌后試驗(yàn)組與對(duì)照組蘭州百合鱗片上的病斑面積差異顯著。不同致病菌對(duì)黃花蒿精油的敏感程度不同，將試驗(yàn)組蘭州百合鱗片上病斑面積顯著小于對(duì)照組的最小濃度定義為最佳防治濃度，病原細(xì)菌B-6對(duì)黃花蒿精油最為敏感。當(dāng)黃花蒿精油濃度為15.38 μL/L時(shí)，試驗(yàn)組蘭州百合病斑面積顯著小于對(duì)照組，表明黃花蒿精油對(duì)蘭州百合的最佳防治濃度為15.38 μL/L。

表2 黃花蒿精油對(duì)蘭州百合病斑面積的影響

由表3 可知，對(duì)照組蘭州百合接種病原菌后快速發(fā)生腐敗，病斑面積顯著大于試驗(yàn)組，表明桉葉油醇能夠有效降低病原菌在蘭州百合體內(nèi)的生長(zhǎng)速率，減緩蘭州百合腐爛。此外，桉葉油醇對(duì)蘭州百合采后病原菌的體內(nèi)防治具有劑量依賴性，隨著桉葉油醇濃度增大，病斑面積逐漸減小。當(dāng)桉葉油醇濃度為15.38 μL/L時(shí)，試驗(yàn)組蘭州百合病斑面積顯著小于對(duì)照組，表明桉葉油醇對(duì)蘭州百合的最佳防治濃度為15.38 μL/L。

表3 桉葉油醇對(duì)蘭州百合病斑面積的影響

2.4 黃花蒿精油及其單體桉葉油醇對(duì)F-6侵染后蘭州百合生理生化指標(biāo)的影響

2.4.1 DPPH自由基清除率和褐變度 由圖3可知，蘭州百合DPPH自由基清除率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，接種F-6后對(duì)照組蘭州百合鱗片DPPH自由基清除率快速降低，其降低速率高于試驗(yàn)組，說明黃花蒿精油和桉葉油醇能夠抑制蘭州百合自身抗氧化活性的降低，從而提高蘭州百合的抗逆性。

褐變直接影響蘭州百合的感官色澤，通過測(cè)定褐變過程中產(chǎn)生的可溶性色素含量確定其褐變度。由圖3可知，同一貯藏時(shí)間接種F-6后，對(duì)照組蘭州百合的褐變度顯著高于黃花蒿精油和桉葉油醇的試驗(yàn)組，表明黃花蒿精油和桉葉油醇能夠有效抑制蘭州百合鱗片中可溶性色素物質(zhì)的生成，使褐變速率減慢，保留其本身色澤，從而延長(zhǎng)其貯藏期。

圖中不同小寫字母表示同一時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)。下同

2.4.2 總酚和類黃酮含量 蘭州百合鱗片中總酚和類黃酮含量的變化如圖4所示。由圖4可以看出，蘭州百合鱗片中總酚和類黃酮含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且在貯藏第3～9天時(shí)，對(duì)照組蘭州百合鱗片中的總酚和類黃酮含量均顯著低于黃花蒿精油和桉葉油醇試驗(yàn)組。

圖4 黃花蒿精油及桉葉油醇對(duì)蘭州百合總酚和類黃酮含量的影響

2.4.3 可溶性糖含量 果蔬中可溶性糖含量的多少與其品質(zhì)、成熟度及貯藏期密切相關(guān)。由圖5可知, 蘭州百合鱗片中可溶性糖含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，且在貯藏第3～9天時(shí)，對(duì)照組蘭州百合鱗片中的可溶性糖含量均顯著低于黃花蒿精油和桉葉油醇試驗(yàn)組。

圖5 黃花蒿精油及桉葉油醇對(duì)蘭州百合可溶性糖含量的影響

2.4.4 MDA含量 MDA是膜不飽和脂肪酸過氧化的次要終產(chǎn)物，其可以與蛋白質(zhì)和核酸等大分子發(fā)生反應(yīng)，改變其構(gòu)型或使之產(chǎn)生交聯(lián)反應(yīng)，從而喪失生物功能；此外，MDA還會(huì)導(dǎo)致纖維素分子間的橋鍵松弛，因此MDA積累會(huì)對(duì)果蔬的細(xì)胞壁膜及細(xì)胞器造成一定傷害，已被用于果實(shí)發(fā)育過程中膜傷害的直接指示物。由圖6可知，對(duì)照組蘭州百合鱗片中MDA含量顯著高于黃花蒿精油處理組，表明病原菌侵染后會(huì)加劇蘭州百合鱗片中MDA含量積累，而黃花蒿精油能夠抑制MDA含量增加，從而延長(zhǎng)蘭州百合貯藏期。

圖柱上不同小寫字母表示不同處理差異顯著(P<0.05)

2.4.5 保護(hù)酶活性 SOD廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，不僅可以清除超氧自由基，還能夠與過氧化氫酶(CAT)及POD協(xié)同作用來防御活性氧或其他過氧化物自由基對(duì)動(dòng)植物及微生物細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而減少有機(jī)體中自由基的毒害作用。因此，SOD在誘導(dǎo)植物抗逆性方面發(fā)揮著重要作用。由圖7可知，不同處理組蘭州百合鱗片SOD活性均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，且黃花蒿精油處理組顯著高于對(duì)照組。

圖7 黃花蒿精油及桉葉油醇對(duì)蘭州百合SOD活性的影響

PPO和POD是果蔬體內(nèi)普遍存在的重要氧化還原酶，與果蔬的生理生化過程密切相關(guān)，能夠促進(jìn)酚類物質(zhì)生成顏色較深的醌類物質(zhì)，導(dǎo)致果蔬發(fā)生酶促褐變。蘭州百合鱗片中PPO和POD活性如圖8所示。由圖8可知，病原菌侵染后，蘭州百合鱗片POD和PPO活性均急劇升高，處理第6天后對(duì)照組蘭州百合鱗片POD和PPO活性均顯著高于試驗(yàn)組，且第 6天后對(duì)照組蘭州百合POD活性急劇降低。POD和PPO活性與蘭州百合鱗片褐變結(jié)果一致。表明黃花蒿精油及桉葉油醇能夠有效抑制蘭州百合鱗片POD和PPO活性，從而抑制其體內(nèi)總酚類物質(zhì)被氧化，降低了蘭州百合鱗片的褐變度，延長(zhǎng)貯藏期。

圖8 黃花蒿精油及桉葉油醇對(duì)蘭州百合PPO和POD活性的影響

2.4.6 不同生理生化指標(biāo)間的相關(guān)性 病原菌侵染后蘭州百合的褐變度與總酚、類黃酮含量以及PPO和POD活性相關(guān)性結(jié)果如表4所示。由表4可知，蘭州百合的褐變度與其體內(nèi)總酚含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與PPO活性呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；蘭州百合鱗片中總酚含量與PPO活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。表明病原菌侵染后蘭州百合褐變可能是由于，PPO活性迅速增加使酚類物質(zhì)氧化形成棕色聚合物，進(jìn)而導(dǎo)致蘭州百合顏色加深。

表4 蘭州百合褐變度與總酚、類黃酮、POD和PPO的相關(guān)性

3 討 論

本研究結(jié)果表明，黃花蒿精油和桉葉油醇均具有良好的抑菌效果，且對(duì)不同病原菌的敏感度不同。研究發(fā)現(xiàn)黃花蒿精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉具有良好的抑菌活性[23-24]。桉葉油醇對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌等多種病原細(xì)菌和腐敗生物具有較強(qiáng)的抗菌作用[25-26]。從掃描電鏡結(jié)果可知，黃花蒿精油及其單體桉葉油醇主要是通過破壞病原菌菌體細(xì)胞壁的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物滲出，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡，這與Oliveira等[27]的結(jié)果一致。黃花蒿精油的主要成分是萜烯類化合物，因其具有疏水性可以聚集在細(xì)胞膜上，改變膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物泄露，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13,28]。 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，黃花蒿精油及其單體桉葉油醇的濃度為15.38 μL/L時(shí)，蘭州百合的病斑面積顯著低于對(duì)照組，并且桉葉油醇對(duì)病原真菌的抑菌活性比黃花蒿精油強(qiáng)，這可能是黃花蒿精油中萜類化合物破壞了蘭州百合部分細(xì)胞壁，促進(jìn)了病原真菌在其鱗片中的生長(zhǎng)[29]。

生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明，黃花蒿精油及其單體桉葉油醇減緩了蘭州百合鱗片中可溶性糖含量的降低，這與Chen等[19]的研究中ATP對(duì)采后龍眼果實(shí)的相關(guān)指標(biāo)變化趨勢(shì)一致，說明黃花蒿精油及其單體桉葉油醇能夠保持蘭州百合原有的風(fēng)味并延長(zhǎng)其貯藏期。黃花蒿精油和桉葉油醇處理后蘭州百合鱗片中MDA含量較低，可能是由于處理后激活防御相關(guān)酶的誘導(dǎo)效應(yīng)。因此，根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果和前人的研究[30]表明，精油及其單體可以通過控制膜脂過氧化來減輕蘭州百合或其他果蔬作物中真菌侵染導(dǎo)致的腐爛。研究發(fā)現(xiàn)，抗氧化酶在增強(qiáng)蘭州百合抗逆性、延緩衰老方面起著重要的調(diào)節(jié)作用[21]。在接種病原菌后，蘭州百合鱗片中SOD活性隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，表明SOD在蘭州百合抗逆性中起主要作用。此外，黃花蒿精油及桉葉油醇處理蘭州百合鱗片后，抑制了DPPH自由基清除活性的降低。推測(cè)黃花蒿精油和桉葉油醇能夠增加被病原菌侵染后蘭州百合體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，從而增強(qiáng)果實(shí)的抗逆性，延緩衰老。果蔬的表觀色澤是評(píng)價(jià)果蔬品質(zhì)的最重要指標(biāo)，與果蔬的表觀品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值密切相關(guān)。POD是苯丙烷類代謝途徑中誘導(dǎo)合成的關(guān)鍵酶，而PPO在植物體內(nèi)的活性氧代謝中起著重要作用，并將酚類化合物氧化成有毒的醌類化合物來抑制病原菌的生長(zhǎng)[30]。本研究中，通過對(duì)病原菌侵染后蘭州百合的褐變度、總酚、類黃酮含量以及PPO和POD活性進(jìn)行相關(guān)性分析可知，蘭州百合的褐變主要是，受到外界環(huán)境脅迫時(shí)蘭州百合鱗片中PPO活性增加，催化體內(nèi)總酚類物質(zhì)生成醌類等有毒的深色物質(zhì)，使蘭州百合表面顏色加深，這與Chen等[19]的研究結(jié)果一致。綜上，黃花蒿精油及桉葉油醇處理蘭州百合后抑制了病原菌在蘭州百合體內(nèi)的生長(zhǎng)與繁殖，并且誘導(dǎo)了其體內(nèi)防御相關(guān)酶活性的增加，降低了氧化損傷，延長(zhǎng)了蘭州百合的貯藏期。