急性腦梗死患者血清MMP-9、miR-221表達(dá)水平檢測及臨床價值探索

馮佳佳， 劉 丹， 張廣煒， 金麗霞

急性腦梗死(acute cerebral infarct，ACI)是神經(jīng)內(nèi)科及急診科最常見的急危重癥之一。據(jù)統(tǒng)計，在我國ACI約占腦卒中總發(fā)病率的80%[1]，其致殘率、致死率、復(fù)發(fā)率極高。但ACI的早期診斷仍局限于影像學(xué)，具有診斷意義的循環(huán)標(biāo)志物尚未發(fā)現(xiàn)。近年來諸多研究證實，約20%的miRNAs在ACI患者的外周血中表達(dá)異常且與其病理相關(guān)[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一組蛋白水解性鋅依賴內(nèi)肽酶，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理生理過程[3]。其中MMP-9在ACI的研究已經(jīng)有一定的歷史背景，但miR-221在腦血管疾病領(lǐng)域的研究尚少。因此本研究旨在探討ACI患者血清MMP-9、miR-221表達(dá)水平，并分析二者聯(lián)合檢測對ACI的診斷價值，若能達(dá)到預(yù)期結(jié)果，二者聯(lián)合檢測有望成為ACI的診斷性循環(huán)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年12月-2021年12月在我科收治的ACI患者50例為病例組，同期健康體檢者50例為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合1996年全國第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會議修訂的腦梗死診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭部CT或MRI檢查證實；(2)滿足CISS分型標(biāo)準(zhǔn)，CISS分型為動脈粥樣硬化性腦梗死；(3)年齡≥18歲，發(fā)病時間≤7 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有腦出血病史或CT顯示腦出血；(2)有明顯的心、肝、腎功能不全及惡性腫瘤；(3)存在心房顫動等嚴(yán)重心律失常；(4)心源性栓塞所致的腦卒中患者。本實驗通過科研倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1 ELISA檢測血清MMP-9的含量 用干燥管收集患者入院次日清晨空腹肘靜脈血4 ml，常溫下3000 rpm離心5 min，用高壓滅菌的EP管收集分離后的上層血清，-80 ℃保存，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測MMP-9的含量，操作流程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書(武漢新啟迪生物科技有限公司)進(jìn)行。

1.2.2 qRT-PCR檢測血清miR-221的表達(dá)水平 用EDTA管收集患者入院次日清晨空腹肘靜脈血2 ml，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-221的表達(dá)水平。按照Trizol試劑說明書(Invitrogen life technologies公司)抽提血清總RNA。cDNA合成：取總RNA樣品800 ng(8 μl)，加入緩沖液，Mix共20 μl，RT反應(yīng)條件為：16 ℃，30 min；42 ℃，40 min；85 ℃，5 min，-20 ℃保存。實時定量PCR：U6作為內(nèi)參，在cDNA樣品中加入SYBR Green進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 60 s共40個循環(huán)，用2-△△Ct計算miR-221的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 病例組和對照組臨床資料比較 兩組患者在年齡、TC、TG、LDL-C和HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而性別、高血壓、糖尿病和高脂血癥比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1)。

表1 病例組與對照組臨床資料比較

2.2 病例組與對照組血清MMP-9和miR-221表達(dá)水平比較 病例組患者血清MMP-9的表達(dá)水平(1.77±0.55)(μg/L)顯著高于對照組(1.01±0.22)(μg/L)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，見圖1A)；病例組患者血清miR-221的表達(dá)水平(2.29±2.51)顯著高于對照組(1.13±1.09)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖1B)。

注：病例組與對照組比較**P<0.01,***P<0.001圖1 A：對照組與病例組血清MMP-9的比較；B：對照組與病例組血清miR-221的比較

2.3 病例組與對照組臨床資料及血清MMP-9、miR-221的相關(guān)性分析 ACI與性別、高血壓、糖尿病、高脂血癥、MMP-9、miR-221呈正相關(guān)(P<0.05，見表2)；ACI患者的MMP-9與miR-221不相關(guān)(r=0.193，P=0.055)。

表2 病例組與對照組臨床檢驗和實驗指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4 急性腦梗死發(fā)病危險因素的Logistic回歸分析 以急性腦梗死為因變量，性別、高血壓、高脂血癥、MMP-9、miR-221為自變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，在校正其他危險因素后，結(jié)果顯示性別、高脂血癥、MMP-9、miR-221有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，是ACI發(fā)病的獨立危險因素(見表3)。

表3 急性腦梗死發(fā)病危險因素的Logistic回歸分析

2.5 血清MMP-9、miR-221診斷急性腦梗死的ROC曲線 以預(yù)測概率做ROC曲線(見表4、圖2)，結(jié)果顯示：MMP-9、miR-221的AUC分別為0.899、0.746，聯(lián)合檢測的AUC為0.924，此時的敏感度為82%，特異性為98%。經(jīng)過ROC分析曲線下成對樣本區(qū)域差異計算得出，預(yù)測概率與MMP-9之間AUC差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.041<0.05)。由此得出，MMP-9、miR-221聯(lián)合檢測較單項檢測更有助于ACI的診斷。

圖2 血清MMP-9、miR-221、聯(lián)合檢測診斷急性腦梗死的ROC曲線

表4 ROC曲線分析

3 討 論

動脈粥樣硬化是ACI最重要的病理因素，頸動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊已被列為ACI的極高危險因素[4]。MMP-9通過降解膠原纖維及細(xì)胞外基質(zhì)，使得纖維帽薄弱、頸動脈斑塊不穩(wěn)定，從而形成血栓誘發(fā)腦梗死[5]。前期研究已經(jīng)證實MMP-9在腦梗死發(fā)病2 h內(nèi)會升高[6]，超急性期腦梗死患者血清MMP-9水平與病情嚴(yán)重程度和梗死體積顯著相關(guān)[5]。

本實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，病例組患者血清MMP-9水平顯著增高，且與ACI呈正相關(guān)，Logistic回歸分析顯示MMP-9是ACI發(fā)病的獨立危險因素。ROC曲線分析顯示，當(dāng)MMP-9≥1.384(μg/L)時所對應(yīng)的敏感度是84%，特異性為94%，AUC為0.899，對ACI的診斷價值較高。Choi[7]等人通過大腦中動脈短暫閉塞動物模型發(fā)現(xiàn)，MMP-9是ACI潛在生物學(xué)標(biāo)志，可作為輔助功能評估腦梗死。本實驗結(jié)果與前期研究結(jié)果相符，更加佐證了MMP-9有望成為診斷腦梗死的循環(huán)標(biāo)志物之一。

MiRNAs是一種小的非編碼RNA，通過識別同源序列和干擾轉(zhuǎn)錄、翻譯或表觀遺傳過程來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，參與了許多復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)通路的調(diào)節(jié)[8]。近年來越來越多的證據(jù)表明，循環(huán)miRNAs能夠調(diào)節(jié)ACI病理過程的靶點，被認(rèn)為是ACI潛在的診斷性循環(huán)標(biāo)志物[9]。例如：Zhou[10]等人報道m(xù)iR-21和miR-24的血漿水平可能作為ACI的關(guān)鍵分子介質(zhì)；Wu[11]等人認(rèn)為ACI患者血漿中miR-99b表達(dá)下調(diào)，有可能成為診斷ACI的潛在指標(biāo)。

本實驗主要探討的是病例組血清miR-221的表達(dá)水平與對照組之間的差異，結(jié)果顯示病例組血清miR-221水平顯著高于對照組，Logistic回歸分析顯示：miR-221是ACI發(fā)病的獨立危險因素。ROC曲線顯示：當(dāng)miR-221≥1.146時所對應(yīng)的敏感度是78%，特異性為70%，AUC為0.746，對ACI的診斷價值具有中度準(zhǔn)確性，MMP-9與miR-221聯(lián)合評估時AUC為0.924，對ACI具有較高的診斷效能。Sofie[12]等人研究發(fā)現(xiàn)ACI患者外周血中miR-221-3p與健康對照組相比表達(dá)上調(diào)。Tsai[13]等人研究發(fā)現(xiàn)，miR-221在健康人群中的平均表達(dá)水平最低，其次是動脈粥樣硬化組，腦卒中患者組中表達(dá)最高。Sandra[14]等人研究顯示miR-221在進(jìn)展性頸動脈粥樣硬化患者中表達(dá)顯著增高。我們的實驗結(jié)果與前期研究結(jié)論相符。無獨有偶，研究發(fā)現(xiàn)在急性心肌梗死患者血清中miR-221的表達(dá)水平顯著高于健康對照組[15]；在急性肺栓塞患者血清中miR-221水平也顯著高于健康人群[16]。我們的實驗結(jié)果顯示性別、高脂血癥也是ACI發(fā)生的危險因素，與大量的回顧性研究結(jié)果相吻合[17]。

本研究的不足之處首先在于研究對象的數(shù)量和地域有一定的局限性；其次，本次研究ACI患者的血液樣本是在臨床事件發(fā)生后采集的，所以因果關(guān)系只能推斷；再次，在本實驗所收集的樣本中，對照組和病例組之間是否患有糖尿病是存在顯著差異的，而既往研究表明高血糖可誘導(dǎo)miR-221表達(dá)上調(diào)[15]；最后，藥物治療是否會影響ACI患者血清MMP-9、miR-221表達(dá)水平我們尚不清楚。這些都可能是導(dǎo)致此次實驗結(jié)果的原因。未來期望繼續(xù)擴(kuò)大樣本及嚴(yán)守質(zhì)控來驗證實驗結(jié)果。

綜上所述，MMP-9和miR-221的表達(dá)與ACI的發(fā)生密切相關(guān)，且二者聯(lián)合檢測有助于ACI的早期診斷，有更高的敏感性和特異性，有望成為ACI早期診斷理想的組合靶標(biāo)，值得在臨床上進(jìn)一步的研究和推廣。