Circ_HECTD1調(diào)節(jié)miR-135a-5p/TP53INP1軸對OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷的影響

逯 琴， 張文敏， 趙 敏

腦卒中是一種嚴(yán)重的心腦血管疾病，主要包括缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中主要表現(xiàn)為腦血管破裂或阻塞導(dǎo)致血流量減少，引起神經(jīng)功能受損，最終導(dǎo)致腦部病變，發(fā)病率、致死致殘率均極高[1,2]。缺血性腦卒中的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，多種因素導(dǎo)致神經(jīng)元損傷與凋亡，如代謝異常、氧化應(yīng)激及鈣離子超載等[3]，目前臨床上對于腦卒中仍缺少有效的治療藥物。環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)是一種單鏈環(huán)狀、共價(jià)閉合的非編碼RNA，可通過調(diào)控多種信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4～6]。環(huán)狀RNA含HECT結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶1(circRNA HECT domain E3 ubiquitin ligase 1,Circ_HECTD1)在缺血腦組織中表達(dá)升高，抑制Circ_HECTD1表達(dá)能夠顯著改善腦梗死，減輕神經(jīng)元損傷[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a-5p在氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中表達(dá)減少，過表達(dá)miR-135a-5p能夠顯著改善OGD/R誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡[8]。腫瘤蛋白53誘導(dǎo)型核蛋白1(tumor protein 53-induced nuclear protein 1,TP53INP1)是一種促凋亡蛋白，參與多種腫瘤引起的細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，可誘導(dǎo)細(xì)胞生長停滯，引起細(xì)胞凋亡[9,10]。生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測可知TP53INP1是miR-135a-5p的靶基因。本研究通過進(jìn)行體外OGD/R誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷，觀察Circ_HECTD1對HT22細(xì)胞增殖、凋亡的影響以及對miR-135a-5p/TP53INP1軸的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑 HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞由中科院細(xì)胞生物研究所提供。胎牛血清(FBS,10099-141)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(BT11668-019)均購自美國賽默飛公司；青鏈霉素(R3470)購自北京康納瑞生物公司；si-Circ_HECTD1、miR-135a-5p模擬物(miR-135a-5p)、anti-miR-135a-5p及其陰性轉(zhuǎn)染物(si-NC、miR-NC、anti-miR-NC)、Circ_HECTD1野生型質(zhì)粒(Circ_HECTD1-WT)與突變型質(zhì)粒(Circ_HECTD1-MUT)、TP53INP1野生型質(zhì)粒(TP53INP1-WT)與突變型質(zhì)粒(TP53INP1-MUT)均購自北京六合華大基因公司；TRIzol試劑盒(SH-2366)購自北京凱詩源生物公司；熒光定量PCR檢測試劑盒(BK2100)購自百奧邁科生物公司；MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒(M1020)購自北京索萊寶生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(K201-100)購自北京博邁斯科技公司；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測試劑盒(AAT-12518)購自美國AAT Bioquest公司；Bax抗體(ab182733)、Bcl-2抗體(ab196495)、TP53INP1抗體(ab202026)、羊抗兔二抗(ab6721)購自英國Abcam公司。

1.2 主要儀器 JD-CW16實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自山東競道光電科技有限公司；EXFLOW系列流式細(xì)胞儀購自北京達(dá)科為生物技術(shù)公司；LONZA ELx808酶標(biāo)儀購自美國LONZA公司；Azure Biosystems C150凝膠成像系統(tǒng)購自美國Azure公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組轉(zhuǎn)染 常規(guī)培養(yǎng)復(fù)蘇HT22細(xì)胞，并培養(yǎng)于含10% FBS，1%青鏈霉素雙抗的正常DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合≥80%后采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將si-NC、si-Circ_HECTD1、miR-NC、miR-135a-5p、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p分別轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞中，依次作為si-NC組、si-Circ_HECTD1組、miR-NC組、miR-135a-5p組、si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組、si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組，另將未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為Con組、OGD/R組。

1.4 模型建立 除Con組外，其它7組建立OGD/R模型：棄去原來的培養(yǎng)液，PBS沖洗細(xì)胞，加入不含F(xiàn)BS的無糖DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，轉(zhuǎn)移至含有94%N2、5%CO2、1%O2的缺氧培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，然后更換正常DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至常規(guī)恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.5 qRT-PCR法檢測Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá) 收集各組HT22細(xì)胞，采用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用熒光定量PCR檢測試劑盒檢測Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)，以GAPDH和U6為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。qRT-PCR所需引物：Circ_HECTD1上游引物5’-CACGTGTTATCAGGGGCCTT-3’，下游引物5’-CGCCACCCTTGCTTTTCATC-3’；miR-135a-5p上游引物5’-ACAGCCTCCATGGGAATGGAAGCAGGTTGA-3’，下游引物5’-TGGAGTGTGGCGTTCG-3’；TP53INP1上游引物5’-TGGCACTTATTTCCGCCTGTA-3’，下游引物5’-CGTGGCTGGAAGAAGTAGTGA-3’；U6上游引物5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游引物5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH上游引物5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。

1.6 MTT檢測細(xì)胞活性 收集各組HT22細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個(gè)/ml，接種至96孔板，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞鋪滿孔底，每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μl，搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定吸光度值(OD值)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/Con組OD值×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組HT22細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml。取500 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC溶液和5 μl PI溶液，孵育10 min，混勻后采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-135a-5p與Circ_HECTD1、TP53INP1的靶向關(guān)系 根據(jù)miR-135a-5p與Circ_HECTD1、TP53INP1序列間的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建Circ_HECTD1、TP53INP1野生型和突變型質(zhì)粒載體(Circ_HECTD1-WT與Circ_HECTD1-MUT、TP53INP1-WT與TP53INP1-MUT)，并將其分別與miR-NC和miR-135a-5p共轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值作為相對熒光素酶活性。

1.9 Western blot法檢測Bax、Bcl-2、TP53INP1蛋白表達(dá) 收集各組HT22細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，加入Bax、Bcl-2、TP53INP1一抗，4 ℃孵育過夜，再加入HRP標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育2 h，ECL顯色后使用凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像并分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1在OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷中的表達(dá) 與Con組比較，OGD/R組Circ_HECTD1與TP53INP1 mRNA表達(dá)均上調(diào)，miR-135a-5p表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果(見表1)。

表1 各組HT22細(xì)胞中Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)比較

2.2 沉默Circ_HECTD1表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷及miR-135a-5p、TP53INP1表達(dá)的影響 與Con組比較，OGD/R組HT22細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與OGD/R組、si-NC組比較，si-Circ_HECTD1組Circ_HECTD1、TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，miR-135a-5p表達(dá)升高，存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)升高，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果(見圖1、圖2和表2、表3)。

表2 各組HT22細(xì)胞Circ_HECTD1、miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)存活率、凋亡率比較

表3 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

圖1 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

A：Con組；B：OGD/R組；C：si-NC組；D：si-Circ_HECTD1組圖2 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.3 Circ_HECTD1與miR-135a-5p、miR-135a-5p與TP53INP1的靶向關(guān)系 生物信息學(xué)網(wǎng)站(https://starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測可知，Circ_HECTD1與miR-135a-5p、miR-135a-5p與TP53INP1序列間均具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)(見圖3)。與轉(zhuǎn)染miR-NC比較，轉(zhuǎn)染miR-135a-5p的HT22細(xì)胞中Circ_HECTD1-WT以及TP53INP1-WT的相對熒光素酶活性降低(P<0.05)；但對Circ_HECTD1-MUT和TP53INP1-MUT的相對熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。結(jié)果(見表4)。

表4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

圖3 Circ_HECTD1與miR-135a-5p、miR-135a-5p與TP53INP1結(jié)合位點(diǎn)

2.4 過表達(dá)miR-135a-5p對OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷及TP53INP1表達(dá)的影響 與Con組比較，OGD/R組TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與OGD/R組、miR-NC組比較，miR-135a-5p組miR-135a-5p表達(dá)升高，TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)均降低，細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)升高，凋亡率和Bax蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)果(見圖4、圖5和表5、表6)。

表5 各組HT22細(xì)胞miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)、存活率與凋亡率比較

表6 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

圖4 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

A：Con組；B：OGD/R組；C：miR-NC組；D：miR-135a-5p組圖5 各組HT22細(xì)胞中TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

2.5 抑制miR-135a-5p逆轉(zhuǎn)沉默Circ_HECTD1表達(dá)對OGD/R誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的影響 與si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組比較，si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組miR-135a-5p表達(dá)降低，TP53INP1 mRNA和蛋白表達(dá)升高，細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)果(見圖6、圖7和表7、表8)。

表7 各組HT22細(xì)胞miR-135a-5p、TP53INP1 mRNA表達(dá)、存活率與凋亡率比較

表8 各組HT22細(xì)胞TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組；si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組圖6 各組HT22細(xì)胞凋亡流式圖

A：si-Circ_HECTD1+anti-miR-NC組；B：si-Circ_HECTD1+anti-miR-135a-5p組圖7 各組HT22細(xì)胞TP53INP1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

近年來腦卒中的發(fā)病率與死亡率逐年升高，目前臨床上對于腦卒中的治療藥物主要是神經(jīng)保護(hù)類藥物，其靶點(diǎn)單一，易出現(xiàn)耐藥性，尋找新的治療靶點(diǎn)是腦血管疾病的研究重點(diǎn)[11,12]。細(xì)胞凋亡是缺血性腦卒中神經(jīng)元損傷的主要形式，缺血后腦組織中大量氧自由基的產(chǎn)生導(dǎo)致促炎因子釋放，最終引起細(xì)胞損壞和凋亡[13,14]。海馬區(qū)是腦缺血后最易受損的區(qū)域[15]，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞建立OGD/R誘導(dǎo)細(xì)胞損傷體外模型，結(jié)果顯示，OGD/R誘導(dǎo)后HT22細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)降低，提示海馬神經(jīng)元HT22細(xì)胞受損，細(xì)胞發(fā)生凋亡，與袁美玲等[16]研究結(jié)果一致。

研究發(fā)現(xiàn)[17]，沉默Circ_HECTD1表達(dá)可有效降低癲癇模型小鼠海馬神經(jīng)元凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。另有研究證實(shí)[18]，Circ_HECTD1敲除后，通過調(diào)節(jié)miR-27a-3p/FSTL1軸，減輕OGD/R誘導(dǎo)HT22細(xì)胞損傷，為腦梗死的治療提供新的靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)沉默Circ_HECTD1可通過抑制細(xì)胞凋亡減輕HT22細(xì)胞損傷，與Zhang等[18]研究結(jié)果一致，但具體作用機(jī)制尚不完全清晰。

miR-135a-5p已被證實(shí)在腦缺氧/復(fù)氧損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，M2小膠質(zhì)細(xì)胞來源的miR-135a-5p表達(dá)上調(diào)，抑制神經(jīng)元自噬，減輕缺血性腦損傷[20]。TP53INP1影響OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力，促進(jìn)神經(jīng)元中炎癥與氧化應(yīng)激的發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21,22]。本研究結(jié)果顯示，HT22細(xì)胞中TP53INP1上調(diào)，miR-135a-5p下調(diào)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)TP53INP1是miR-135a-5p的靶基因；且過表達(dá)miR-135a-5p可通過下調(diào)TP53INP1表達(dá)減輕HT22細(xì)胞損傷。另外，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測證實(shí)，miR-135a-5p是Circ_HECTD1的靶基因；且沉默Circ_HECTD1可顯著上調(diào)miR-135a-5p表達(dá)，下調(diào)TP53INP1表達(dá)，而抑制miR-135a-5p表達(dá)能夠顯著逆轉(zhuǎn)沉默Circ_HECTD1對HT22細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。以上研究結(jié)果提示Circ_HECTD1可通過調(diào)控miR-135a-5p/TP53INP1信號(hào)軸發(fā)揮對海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，沉默Circ_HECTD1表達(dá)能夠有效減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷，且其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)miR-135a-5p/TP53INP1信號(hào)軸有關(guān)。但目前缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，Circ_HECTD1在缺血性腦卒中的研究尚少，其具體影響機(jī)制還需進(jìn)一步深入探索。