佛手瓜SePLR基因克隆和生物學分析

趙 倩， 譚國飛， 鐘秀來， 陳志峰， 孟平紅*

(1.貴州大學 生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院， 山地植物資源保護與保護種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省園藝研究所， 貴州 貴陽 550006； 3.遵義師范學院 生物與農(nóng)業(yè)科技學院, 貴州 遵義 563006)

0 引言

【研究意義】佛手瓜[Sechiumedule(Jacq.) Swartz.]又名捧瓜，為葫蘆科多年生草本攀援植物[1-2]。佛手瓜、嫩葉、莖和塊根均可食用，是一種藥食同源蔬菜[3-4]。佛手瓜原產(chǎn)于墨西哥，19世紀傳入中國后在貴州、云南、福建、海南、四川和重慶等地區(qū)種植較多[5-6]。佛手瓜生長快、產(chǎn)量高，瓜平均產(chǎn)量為4 000～6 000 kg/667m2。佛手瓜含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是名副其實的無公害保健蔬菜，對治療胸悶脹氣、疏肝止咳、消化不良等均有一定作用。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，佛手瓜果實中含有生物堿、皂甙、甾醇、飽和脂肪酸、黃酮和鞣質(zhì)[7]，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血糖、保護肝腎等功效[8-10]。佛手瓜作為保健蔬菜，鑒定和分離其營養(yǎng)物質(zhì)合成基因?qū)Ψ鹗止蠣I養(yǎng)物質(zhì)的開發(fā)利用和品種改良具有重要意義。【前人研究進展】木脂素是一類苯丙烷類化合物，常以二聚體形式存在于植物中[11]。目前已發(fā)現(xiàn)的木脂素有200多種，且不同植物中木脂素的類型和作用不同[12]。木脂素是植物中天然存在的保健藥用成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、降血壓及預防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生等藥理作用[13]。植物體受到外界環(huán)境脅迫，特別是受到病原微生物侵害后，導致植物體內(nèi)的木脂素大量合成，用于增強植物的防御能力[14]。松脂醇-落葉松脂酚還原酶(Pinoresinol-lariciresinol reductase, PLR)是木脂素生物合成的關(guān)鍵酶之一。該酶在大多數(shù)植物中可連續(xù)催化兩步還原反應(yīng)[15]，但在擬南芥中僅催化一步還原反應(yīng)[16]。已有研究表明，木脂素的生物合成是從苯丙氨酸開始，苯丙氨酸在一系列酶的催化下生成松柏醇，2個松柏醇通過漆酶或過氧化物酶在聚合蛋白的幫助下偶聯(lián)形成松脂醇(Pinoresinol)[17]。松脂醇在PLR的催化下生成落葉松脂素，落葉松脂素進一步在PLR的催化下生成開環(huán)異落葉松脂素[18]。【研究切入點】目前，PLR基因在五味子、菘藍和其他各科植物中均有報道，佛手瓜中未見研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選用表面青色、無刺的佛手瓜材料為研究對象，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中檢索獲得1條SePLR基因，設(shè)計引物并克隆該基因，以及對佛手瓜SePLR基因展開分子進化分析及在不同組織中的表達分析，為佛手瓜營養(yǎng)物質(zhì)的開發(fā)利用及佛手瓜的種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料及栽培條件 選用種植在貴州省園藝研究所試驗基地的青色、無刺佛手瓜為試驗材料。2021年7月25日，采集同株瓜藤上的花、須、嫩葉、葉柄、嫩莖及不同發(fā)育階段的瓜(授粉5 d、10 d、15 d)，每個樣品設(shè)置3次生物學重復。樣品采集過程中快速用滅菌的手術(shù)刀將不同發(fā)育階段的瓜切成薄片，用錫箔紙包好后快速放入液氮中速凍，并保存于-80℃冰箱中，用于RNA的提取及LC-MS非靶向代謝組學分析。

1.1.2 試劑 RNA Simple Total RNA Kit試劑盒購于北京天根生物技術(shù)有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit (Perfect Real-Time) 、PCR高保真聚合酶Ex Taq、pMD19-T克隆載體、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于大連寶信生物工程有限公司，Axygen膠回收試劑盒購于南京賽泓瑞生物公司，氨芐青霉素(Amp)購于北京索萊寶科技有限公司，甲醇、L-2-氯苯丙氨酸、乙腈、甲酸、異丙醇購于天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Implen超微量分光光度計采購于上海書俊儀器設(shè)備有限公司，冷凍組織研磨儀GD-16Plus采購于深圳市新銳科技發(fā)展有限公司，高速冷凍離心機VL-200R采購于湖南邁克爾實驗儀器有限公司，PCR儀和Bio-Rad PrimePCR儀采購于上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 佛手瓜RNA的提取及cDNA的合成 取保存于-80℃冰箱的佛手瓜樣品，將其分別置于滅菌后的研缽中，使用液氮將采集的佛手瓜樣品研磨成細小粉末，準確稱取0.1 g于2 mL的離心管中，用于佛手瓜總RNA的提取，剩余樣品繼續(xù)保存于-80℃超低溫冰箱中備用。

佛手瓜總RNA的提取按照RNA Simple Total RNA Kit試劑盒說明書進行。提取的佛手瓜總RNA分別使用膠濃度為1.2%瓊脂糖凝膠檢測RNA的完整性，以及使用微量分光光度計Nanodrop ND-100 (Nanodrop Technology Inc., DE,USA)檢測RNA的濃度。隨后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit with a DNA Eraser Kit (Perfect Real-Time)將提取的佛手瓜總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄的cDNA用滅菌的ddH2O稀釋15倍后，保存于-20℃冰箱，用于目的基因的克隆及熒光定量PCR分析。

1.2.2 佛手瓜SePLR基因的克隆與鑒定 從貴州省園藝研究所測定并建立的佛手瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中，通過檢索獲得1條佛手瓜SePLR基因，命名為SePLR1。以該基因序列作為參考，設(shè)計1對克隆引物(SePLR1-KL-F和SePLR1-KL-R，表1)，克隆長度為927 bp。克隆使用PCR高保真聚合酶ExTaq進行目的基因的克隆?？寺◇w系：2×Taq Master Mix 15 μL，正、反引物各1.5 μL、稀釋的cDNA模板2 μL，用滅菌的ddH2O加至30 μL。反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，54℃復性30 s，72℃延伸70 s，34個循環(huán)；72℃延伸5 min；最后12℃保存。PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行目的片段的分離，將鑒定正確的條帶在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀快速切下，之后按照Axygen膠回收試劑盒說明書進行目的片段的回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物按照克隆載體說明書將目的基因連接到pMD19-T克隆載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)100 mg/L氨芐青霉素(Amp)篩選后挑取單菌落進行菌液PCR鑒定。將菌液檢測正確的單菌落，委托生物公司進行目的片段的測序。

表1 佛手瓜SePLR基因克隆的引物

1.2.3 序列生物信息學分析 運用Primer Premier 6.0設(shè)計熒光引物。利用BioXM推測SePLR1編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和等電點。使用MEGA 5.2對從佛手瓜中克隆得到的SePLR1基因的蛋白序列與其余物種中的PLR蛋白序列(表2)進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。SePLR1蛋白質(zhì)親水性和疏水性分析使用DNAMAN。利用NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析SePLR1蛋白結(jié)構(gòu)域，使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進行SePLR蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域預測。

表2 不同物種的PLR1蛋白信息

1.2.4 熒光定量PCR分析 根據(jù)佛手瓜SePLR1基因的克隆測序結(jié)果，設(shè)計1對熒光定量引物(SePLR1-YG-F 和SePLR1-YG-R，表1)。利用該對熒光引物研究SePLR1基因在佛手瓜不同組織中的表達情況。按照SYBR Premix Ex Taq 試劑盒的說明書進行熒光定量分析。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，稀釋的模板cDNA 2 μL，正、反引物各0.5 μL，滅菌的ddH2O 7 μL。以佛手瓜ACTIN為內(nèi)參基因(SeACTIN-F和SeACTIN-R, 表1)，與目的基因一起擴增。每個樣品設(shè)置3次重復。PCR反應(yīng)程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，54℃退火30 s，65℃延伸10 s，40個循環(huán)；最后8℃保存。相對定量表達使用參照基因ΔCT法，表達差異等于2-ΔCT，ΔCT=CT目的基因-CTACTIN，然后根據(jù)試驗結(jié)果繪圖。

1.2.5 LC-MS非靶向代謝組學 取保存于-80℃的佛手瓜樣品，準確稱取0.05 g置于2 mL離心管，加入1顆直徑為6 mm的研磨珠，加入400 μL提取液(V甲醇︰V水=4︰1)，含0.02 mg/mL的內(nèi)標L-2-氯苯丙氨酸)，使用冷凍組織研磨儀在10℃、50 Hz的條件下研磨6 min，隨后低溫超聲(5℃、40 KHz)提取30 min，-20℃靜置30 min，4℃、14 000 r/min離心15 min，移取上清液至帶內(nèi)插管的進樣小瓶中，用于進一步LC-MS非靶向代謝組分析。

LC-MS 分析儀器平臺為AB SCIEX公司的超高效液相色譜串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜UHPLC-Triple TOF系統(tǒng)。色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm i.d.，1.8 μm；Waters，Milford，USA)；流動相A為95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流動相B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水(含0.1%甲酸)；流速為0.40 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為40℃。質(zhì)譜條件：樣品經(jīng)電噴霧電離，分別采用正、負離子掃描模式采集質(zhì)譜信號。

原始數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件ProgenesisQI(WatersCorporation，Milford，USA)進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊等，最終得到含保留時間、質(zhì)荷比和峰強度等信息的數(shù)據(jù)矩陣。其后采用該軟件進行特征峰搜庫鑒定，將MS和MS/MS質(zhì)譜信息與代謝數(shù)據(jù)庫進行匹配，MS質(zhì)量誤差設(shè)置為小于10 mg/L，同時根據(jù)二級質(zhì)譜匹配得分鑒定代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 佛手瓜SePLR1基因的克隆與結(jié)構(gòu)特性

以佛手瓜cDNA為模板，根據(jù)設(shè)計的克隆引物進行PCR擴增獲得目的基因片段(圖1)，條帶清晰，可用于下一步分析。經(jīng)測序，佛手瓜SePLR1基因序列全長927 bp(GenBank: MZ707298)，編碼308 個氨基酸(圖2)。其蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和等電點分別為34.24 kDa和4.66。該基因編碼的蛋白質(zhì)中酸性氨基酸占氨基酸總數(shù)的21.04%，堿性氨基酸占11.33%。SePLR1蛋白質(zhì)含有5個保守結(jié)構(gòu)域(表3)，含有1個NAD(P)結(jié)合位點和1個脯氨酸(Lysine)活性結(jié)構(gòu)域，屬于NADB_Rossmann superfamily超家族。SePLR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α螺旋(Alpha helix)占18.51%，β折疊(Pleated sheet)占25.32%，無規(guī)則卷曲(Random coil)占56.17%。該蛋白質(zhì)具有疏水和親水兩重特性(圖3)。三級結(jié)構(gòu)模型預測顯示，SePLR1蛋白具有20個α螺旋和一些無規(guī)則卷曲(圖4)。通過對SePLR1蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預測可知，SePLR1蛋白中無規(guī)則卷曲所占的比重較大。

注：M為標準分子量。

注：*表示終止密碼子。

表3 SePLR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

圖3 佛手瓜SePLR1氨基酸序列疏、親水性

圖4 佛手瓜SePLR1蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型

2.2 佛手瓜SePLR進化樹

由圖5可見，佛手瓜和其余28種植物及4種微生物的PLR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹，植物和微生物在進化上存在一定差異，分成二個大分枝。SePLR1基因編碼的氨基酸序列在同一個科的植物中進化更為保守，聚集在同一個分枝，如葫蘆科、茄科、楊柳科、豆科、蕓香科、十字花科、菊科、棕櫚科；但同屬于薔薇科桃、甜櫻桃與蘋果并不在同一分枝。葫蘆科和蕓香科及薔薇科的蘋果進化關(guān)系較近；佛手瓜與同屬于葫蘆科的冬瓜、甜瓜、黃瓜親緣關(guān)系較近，但與同一個科的其他物種在進化上卻存在一定距離。

圖5 佛手瓜SePLR氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.3 佛手瓜SePLR基因在不同組織中的表達

由圖6可見，通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測，SePLR1在佛手瓜不同組織中的表達特異性不同，SePLR在小瓜中表達量最高，在莖中表達量最低。佛手瓜不同部位SePLR基因的表達表現(xiàn)為小瓜>花>中瓜>須=葉>老瓜>大瓜>葉柄>莖。

注：不同小寫字母表示差異達顯著水平。

2.4 佛手瓜木脂素種類

通過LC-MS代謝組學方法從佛手瓜中鑒定出2種木脂素(表4)，分別是Sesaminol glucosyl-(1->2)-glucoside[芝麻氨基葡萄糖基-(1->2)-葡萄糖苷]和(8S,8′S)-Secoisolariciresinol 9-xyloside[(8S，8′S)-癸二烯酸樹脂醇9-木糖苷]。

表4 佛手瓜木脂素種類

3 討論

木脂素存在于植物的各部位[19]，PLR是木脂素生物合成的關(guān)鍵酶和限速酶之一，且PLR在不同植物間及同一物種內(nèi)不同發(fā)育階段和不同組織中的表達存在顯著性差異[20-21]。菘藍是木脂素豐富的藥用植物，XIAO等[22]從菘藍中克隆得到PLR基因，對菘藍木脂素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PLR的研究發(fā)現(xiàn)，PLR基因在菘藍根中表達量最高、花中表達量最低。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，佛手瓜的各部位均有SePLR基因表達，小瓜中SePLR1基因表達量最高，莖中表達量最低，且在瓜發(fā)育的4個時期SePLR1基因的表達也存在顯著差異。佛手瓜嫩和老均影響其口感[23]。大瓜是佛手瓜果實的最佳食用期，但在瓜發(fā)育期間SePLR1基因在大瓜中的表達量最低。研究發(fā)現(xiàn)，不同植物的PLR在進化上相對保守，表明PLR的氨基酸序列、基因序列在不同植物中的一致性均較高。通過同源比較發(fā)現(xiàn)，葫蘆科和蕓香科、薔薇科的親緣關(guān)系較近；且佛手瓜與冬瓜、甜瓜、黃瓜中的SePLR1蛋白的進化關(guān)系最近。

HEMMATI等[24]發(fā)現(xiàn)，亞麻中有多達5個PLR基因，但目前只研究了2個，命名為LuPLR1和LuPLR2。研究表明，PLR1基因在亞麻種子發(fā)育的初期表達量增加；LuPLR1和LuPLR2基因在亞麻根和種子中均有表達，但僅在亞麻的莖和葉檢測到LuPLR2基因的表達。NAKATSUBO等[16]擬南芥中克隆2個PLR基因，將其命名為AtPrR1和AtPrR2；FUJITA等[25]從北美喬柏中克隆得到3個PLR基因(TpPLR1、TpPLR2.2、TpPLR3)。該研究中，對建立的佛手瓜數(shù)據(jù)庫中表明，可能佛手瓜中SePLR含有3個及以上。同時，該研究利用LC-MS代謝組分析，初步鑒定出2種木脂素，這2種木脂素成分未找到相關(guān)研究報道，特有性和藥用保健功能，以及準確的分子結(jié)構(gòu)需要進一步研究。下一步將對佛手瓜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行檢索，進一步確定佛手瓜中合成木脂素的關(guān)鍵酶基因SePLR的數(shù)量和木脂素成分，探究佛手瓜在受到不同環(huán)境脅迫后SePLR基因的表達情況和木脂素含量之間的變化關(guān)系。

4 結(jié)論

選用貴州栽培面積最大的青色、無刺佛手瓜作為材料，克隆木脂素合成關(guān)鍵酶基因SePLR，并對SePLR基因進行初步生物信息學分析，該基因全長927 bp，編碼氨基酸為308個，酸性氨基酸比堿性氨基酸多。該蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量和等電點分別為34.24 KDa和4.66。SePLR1蛋白含有NAD(P)和脯氨酸(Lysine)的結(jié)合位點，且具有疏水和親水性。SePLR1蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)元件是β-折疊和無規(guī)卷曲。佛手瓜SePLR1與同屬于葫蘆科的冬瓜、甜瓜、黃瓜的親緣關(guān)系較近，且葫蘆科和蕓香科進化關(guān)系較近。SePLR1在小瓜中表達量最高，其次是花，在莖中表達量最低。此外，通過LC-MS代謝組學從佛手瓜中鑒定出Sesaminol glucosyl-(1->2)-glucoside[芝麻氨基葡萄糖基-(1->2)-葡萄糖苷]和(8S,8′S)-Secoisolariciresinol 9-xyloside[(8S，8′S)-癸二烯酸樹脂醇9-木糖苷]2種木脂素成分，為佛手瓜木脂素成分的開發(fā)利用及佛手瓜新種質(zhì)的創(chuàng)新提供理論參考。