Prkdc和Il2rg雙敲除免疫缺陷小鼠的構(gòu)建和初步應(yīng)用

尹 媛，曾文滔，周建麗，梅 云，王 穎，李建民，2，賴婭娜

1南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇省醫(yī)藥動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，2南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系，江蘇 南京 211166

腫瘤動(dòng)物模型在模擬人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性以及腫瘤藥物研發(fā)、靶點(diǎn)篩選、個(gè)性化治療領(lǐng)域扮演著至關(guān)重要的角色。過(guò)去幾十年，以NCI?60為代表的細(xì)胞系移植動(dòng)物模型廣泛用于癌癥生物學(xué)的研究。但既往的研究表明，人類癌癥細(xì)胞系在移植時(shí)會(huì)由于不明原因失去它們最初的腫瘤特征，如遺傳信息、生長(zhǎng)侵襲特性的改變及腫瘤異質(zhì)性的丟失［1］。因此，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所最終決定用患者來(lái)源的異種移植物（PDX）替代NCI?60用于藥物篩選［2］。

PDX 是通過(guò)將患者腫瘤樣本直接移植到免疫功能低下或免疫受損的小鼠構(gòu)建動(dòng)物模型。PDX模型的一個(gè)顯著優(yōu)勢(shì)是移植后的腫瘤在借助移植受體提供維持其在體內(nèi)生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)支持的情況下，保留了患者腫瘤包括腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)譜和異質(zhì)性等關(guān)鍵特征［3-4］，從而在藥效評(píng)價(jià)［5］、生物標(biāo)志物的篩選［6］和預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物響應(yīng)程度［7］等研究中都具有很高的應(yīng)用價(jià)值。為成功建立PDX模型，需要選擇合適的免疫缺陷小鼠品系作為腫瘤組織移植的受體，裸鼠、SCID以及NOD/SCID等一系列免疫功能高度低下的小鼠被嘗試用作人類腫瘤異種移植的標(biāo)準(zhǔn)受體。NOG/NSG小鼠是免疫功能最差的小鼠，對(duì)正常和惡性人體組織的移植效率最高［8］。然而，受到技術(shù)壁壘和使用限制，NOG/NSG 的售價(jià)相對(duì)較高（在日本用于學(xué)術(shù)用途的每只小鼠售價(jià)為100美元），而且用戶不能自行繁育這些小鼠。本研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了NOD 背景的Prkdc 和Il2rg 雙敲除免疫缺陷小鼠，命名為NYG小鼠，為腫瘤研究和藥物評(píng)估提供了良好的PDX模型。

1 材料和方法

1.1 材料

pX330?U6?Chimeric_BB?CBh?hSpCas9 質(zhì)粒（Plasmid#42230）由美國(guó)Addgene公司提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障中飼養(yǎng)繁殖，符合南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理管理規(guī)范（倫理號(hào)：IACUC?2011031）。ICR 小鼠受體、結(jié)扎鼠購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。NOD 小鼠購(gòu)自北京維通利華生物技術(shù)有限公司和南京大學(xué)模式生物研究所。

MESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit 試劑盒（AM1345，Ambion 公司，美國(guó)），HiScribeTMT7 High yield RNA Synthesis Kit 試劑盒（E2040S）、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶（M0202S）（NEB 公司，美國(guó)），膠回收試劑盒（9762，TaKaRa公司，日本），小鼠組織DNA 抽提試劑盒（PD101?01）及PCR 相關(guān)試劑（P213?03）（南京諾唯贊），血清（Hyclone 公司，美國(guó)），RPMI 1640 培養(yǎng)基（Gibco 公司，美國(guó)），DMSO（Sigma公司，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 CRISPR敲入方案的設(shè)計(jì)

小鼠Prkdc（16 Chr，gene ID：19090，NCBI Refer?ence Sequence：NC_000082.7）和Il2rg（X Chr，GENE ID：16186，NCBI Reference Sequence：NC_000086.8）基因組序列來(lái)自NCBI，CAS9 設(shè)計(jì)軟件來(lái)自CRISPOR.ORG，采 用http：//crispr.dbcls.jp 和http：//asia.ensembl.org/Multi/Tools/Blast 進(jìn)行脫靶分析，每個(gè)基因分別設(shè)計(jì)2個(gè)靶點(diǎn)（表1），設(shè)計(jì)的靶序列構(gòu)建至PT7?CRISP 載體（自構(gòu)），經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后，用HiS?cribeTMT7 High yield RNA Synthesis Kit 試劑盒體外合成sgRNA。PX330 質(zhì)粒（Addgene）擴(kuò)增全長(zhǎng)Cas9基因，用MESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit 試劑盒轉(zhuǎn)錄Cas9 mRNA，-80 ℃保存待用。

表1 目標(biāo)靶點(diǎn)信息Table 1 Target information

1.2.2 顯微注射與胚胎移植

將Prkdc 及Il2rg sgRNA、Cas9 mRNA 用無(wú)RNA酶水混合稀釋至終濃度為20、50 ng/μL，將混合液用顯微操作儀注射入NOD 小鼠0.5 d 受精卵雄原核中，注射完成后將受精卵吸入預(yù)熱的M16 液滴中，清洗3遍，植入0.5 d的假孕ICR小鼠輸卵管中。

1.2.3 F0代小鼠的基因型鑒定

受精卵移植的假孕母鼠單籠飼養(yǎng)20 d后，觀察出生情況。小崽長(zhǎng)至7 d，趾標(biāo)法進(jìn)行小鼠編號(hào)。剪下的腳趾以鼠尾組織標(biāo)本試劑盒提取基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。PCR條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增35 個(gè)循環(huán)，PCR 產(chǎn)物直接送蘇州金唯智生物科技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序序列用GENESNAP軟件分析靶序列，選擇陽(yáng)性小鼠傳代建系。鑒定引物序列如下，mPrkdc?tF：5′?GCCTGGCTGAAAGTGTAT?3′，mPrkdc ? tR：5′ ? TTCAAGGCAGGTTAGGAC ? 3′ ；mIl2rg?tF：5′?TGAGGACCCAATCAAGTG?3′，mIl2rg?tR：5′?GGCTACTTCTTTCCCGATTA?3′。

1.2.4 流式分析B細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞

取8周齡NYG 小鼠和野生型BALB/C 經(jīng)尾靜脈采集外周血細(xì)胞100 μL，直接免疫熒光抗體標(biāo)記法染色，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分別用CD3、CD19 和NKp46表達(dá)情況，用比對(duì)T、B和NK細(xì)胞的組成。

1.2.5 NYG小鼠用于PDX模型的成瘤實(shí)驗(yàn)

收集臨床新鮮剩余手術(shù)腫瘤組織，盡快移至動(dòng)物房生物安全柜內(nèi)，取部分腫瘤組織分別置于70%RPMI1640培養(yǎng)基、20%胎牛血清和10%DMSO組成的保存溶液中液氮凍存及福爾巴林溶液中待用；另取部分腫瘤組織用RPMI1640培養(yǎng)基清洗，2 h內(nèi)去除壞死組織后，將腫瘤組織切成若干2 mm×2 mm×2 mm小塊；NYG小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液，麻醉劑量為60 mg/kg，備皮消毒，開(kāi)（6±2）mm切口，背部皮下移植接種，縫合后在屏障內(nèi)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)荷瘤小鼠2～3個(gè)月，每周觀察小鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況，首次生長(zhǎng)的腫瘤為F0 代。待移植瘤長(zhǎng)徑增長(zhǎng)至1～2 cm，麻醉脫臼處死小鼠，剝離腫瘤組織，液氮冷凍。皮下移植的腫瘤，每7 d 測(cè)量1 次腫瘤的長(zhǎng)徑（L）與短徑（W），計(jì)算腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式為V=1/2×（L×W2），繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到1 cm時(shí)傳代或凍存。

1.2.6 組織病理分析

臨床剩余腫瘤組織和PDX 模型分離的腫瘤組織經(jīng)中性福爾馬林固定制備組織切片，用HE染色，比較患者腫瘤組織與PDX模型腫瘤組織異同。

2 結(jié)果

2.1 NYG純合子小鼠的獲得和基因型的PCR鑒定

將sgRNA、Cas9 mRNA原核注射至受精卵細(xì)胞質(zhì)中，移植后20 d小鼠出生，共計(jì)生仔39 只。以苯酚/氯仿法抽提鼠尾DNA，以目標(biāo)外顯子上下游引物mPrkdc?tF/mPrkdc?tR 及mIl2rg?tF/mIl2rg?tR 鑒定F0 代小鼠。瓊脂糖凝膠電泳，野生型小鼠Prkdc 及Il2rg擴(kuò)張條帶大分別為376 bp及359 bp。F0代首建小鼠性成熟后與NOD 野生型小鼠交配，獲得F1代雜合子小鼠，再通過(guò)雜合子小鼠自交獲得可穩(wěn)定遺傳的F2 代Prkdc 及Il2rg 敲除NYG 純合子小鼠模型。具體的鑒定策略及電泳結(jié)果見(jiàn)圖1，測(cè)序結(jié)果顯示Prkdc 缺失10 個(gè)堿基，Il2rg 缺失50 個(gè)堿基。

圖1 PCR鑒定NYG小鼠Figure 1 PCR identification result of NYG mice

2.2 FCM檢測(cè)NYG小鼠的外周血免疫細(xì)胞

與野生型BALB/C 小鼠相比，NYG 小鼠CD3、CD19 和NKp46 的相對(duì)應(yīng)區(qū)域沒(méi)有熒光，說(shuō)明NYG小鼠外周血中表達(dá)CD3、CD19和NKp46的成熟T、B和NK細(xì)胞不存在，見(jiàn)圖2。

圖2 NYG小鼠外周血CD3+CD19+NKp46+表達(dá)情況Figure 2 CD3+CD19+NKp46+expressed on peripheral blood cells of NYG mice

2.3 人源化異種移植PDX模型原代腫瘤成瘤結(jié)果

NYG 小鼠皮下種植原代腫瘤組織后，飲食、活動(dòng)及生長(zhǎng)均良好，體重未出現(xiàn)明顯下降。腫瘤種植2 周后，測(cè)量移植手術(shù)組織的PDX 腫瘤體積。部分PDX 模型體積的變化趨勢(shì)和小鼠移植后腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài)見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，手術(shù)2 周后，腫瘤組織生長(zhǎng)出現(xiàn)增快的趨勢(shì)，NYG?PDX成瘤正常。

圖3 肝癌/結(jié)腸癌PDX模型的生長(zhǎng)趨勢(shì)和狀態(tài)Figure 3 HCC/Colon cancer PDX model growth characterization

2.4 患者原發(fā)腫瘤和PDX腫瘤的組織學(xué)比較

用NYG 小鼠構(gòu)建的PDX 模型腫瘤組織病理特征與手術(shù)患者的組織病理特征類似。HE 染色結(jié)果示，癌組織浸潤(rùn)性生長(zhǎng)。4 例患者原發(fā)腫瘤和PDX腫瘤形態(tài)相似（圖4），PDX 腫瘤保留了原發(fā)腫瘤的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。

圖4 4例原代腫瘤和PDX腫瘤HE染色比較（×100）Figure 4 Comparison of HE staining between primary tumor and PDX tumor of 4 patients（×100）

3 討論

Il2rg 是多種重要免疫因子的共同受體亞基，在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。敲除Il2rg 將導(dǎo)致多種細(xì)胞因子受體傳遞信號(hào)受阻，NK缺陷和T、B淋巴細(xì)胞減少的表型［2］。得益于CRISPR/Cas9的廣泛應(yīng)用和深入研究，這一系統(tǒng)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞中［9］。本研究中應(yīng)用CRISPR/Cas9 技術(shù)，成功構(gòu)建了PrkdcscidIl2rgnull免疫缺陷NYG 小鼠。與國(guó)際公認(rèn)的免疫缺陷程度最高、最適合人源細(xì)胞或組織移植的PDX工具鼠（NSG、NOG、NCG、B?NDG［2］）一樣，NYG 鼠為NOD?PrkdcscidIl2rgnull同系產(chǎn)品。測(cè)序結(jié)果顯示，NYG 小鼠Prkdc 基因缺失10 個(gè)堿基，Il2rg缺失50個(gè)堿基。外顯子處堿基的缺失，導(dǎo)致這兩個(gè)基因產(chǎn)生移碼突變?cè)斐傻墓δ芨淖儭Ａ魇郊?xì)胞檢測(cè)的結(jié)果也再次證實(shí)了NYG免疫缺陷小鼠體內(nèi)沒(méi)有T細(xì)胞、成熟的B細(xì)胞和NK細(xì)胞的存在（圖2）。

腫瘤異質(zhì)性是影響治療效果的一個(gè)重要決定因素。腫瘤治療的最終目標(biāo)是為每位患者提供量身定制的個(gè)性化治療方案，并根據(jù)個(gè)體的特定生物學(xué)特性及其獨(dú)特的腫瘤性質(zhì)等要求，開(kāi)發(fā)個(gè)性化的治療方法以針對(duì)特定的腫瘤類型和進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。通過(guò)全面了解腫瘤亞型內(nèi)部和之間的差異以及每個(gè)患者腫瘤內(nèi)部的分子和細(xì)胞異質(zhì)性，并將這些差異與臨床行為聯(lián)系起來(lái)，以便開(kāi)展“個(gè)性化”的精準(zhǔn)治療。PDX模型作為發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證平臺(tái)，相對(duì)于細(xì)胞系移植模型臨床治療反應(yīng)預(yù)測(cè)性5%的準(zhǔn)確度，使用PDX 模型可將其提高至80%或更高［10］。與傳統(tǒng)的細(xì)胞系腫瘤模型相比，PDX 將患者的新鮮腫瘤細(xì)胞或組織通過(guò)原位或者異位（多為皮下或腎包膜）等方式移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，能更為真實(shí)地再現(xiàn)原發(fā)腫瘤的生理、生化和腫瘤學(xué)等方面的特征，是目前最理想的研究患者個(gè)體化治療的腫瘤模型［12］。本研究采用手術(shù)獲取的原代肝癌和結(jié)腸癌組織進(jìn)行了PDX 模型的初步構(gòu)建，這兩種常見(jiàn)腫瘤均在NYG 小鼠異種移植獲得成功。通過(guò)對(duì)組織切片的觀察，移植腫瘤與患者腫瘤病理組織形態(tài)表現(xiàn)出高度的一致性，反映出NYG小鼠用于PDX模型開(kāi)展臨床前應(yīng)用研究的潛力。受實(shí)驗(yàn)條件的限制，本研究中參與構(gòu)建PDX模型的腫瘤類型有限，而藥物篩選、療效預(yù)測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域的研究未能開(kāi)展。但既有的免疫學(xué)、病理學(xué)檢查及異種腫瘤移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果已展示出NYG成為PDX模型的良好應(yīng)用前景。