高效液相色譜法測(cè)定保健食品中蘆薈苷的不確定度評(píng)定

伍 曦

（貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州貴陽 550001）

測(cè)量不確定度（Uncertainty of Measurement）是測(cè)量結(jié)果關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù)，用于表征合理賦予被測(cè)量值的分散性。由測(cè)量所得的值只是被測(cè)量的估計(jì)值，測(cè)量過程中的隨機(jī)性及系統(tǒng)性均會(huì)導(dǎo)致測(cè)量不確定度。完整的測(cè)量結(jié)果應(yīng)包含被測(cè)量的估計(jì)值以及與測(cè)量不確定度有關(guān)的信息[1]。不確定度評(píng)定在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測(cè)、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制以及官方檢測(cè)報(bào)告中越來越受到重視。蘆薈苷，又稱為蘆薈素、蘆薈甙，其主要為好望角蘆薈、庫拉索蘆薈、斑紋蘆薈等的提取物。蘆薈苷具有抗菌性，可以促進(jìn)血液循環(huán)、凈化血液、軟化血管、降低血液黏度與血壓，從而降低動(dòng)脈硬化和腦溢血的發(fā)生率[2]。因此，在保健食品中應(yīng)用比較廣泛。然而，蘆薈苷易被分解氧化為蘆薈大黃素，蘆薈大黃素結(jié)構(gòu)與大黃素相似，這種1,8-二羥基蒽醌結(jié)構(gòu)，有致癌和腎損傷危險(xiǎn)[3]。因此，在含蘆薈苷的保健食品中測(cè)定蘆薈苷的含量尤為重要。根據(jù)《化學(xué)分析不確定度評(píng)定》（JJF 1135—2005）和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012），采用高效液相色譜法對(duì)保健食品中蘆薈苷的含量進(jìn)行測(cè)定，建立其不確定度的模型，分析在實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的不確定度來源，找到主要的影響因素，以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，為選擇蘆薈苷含量測(cè)定的方法及結(jié)果的質(zhì)量控制提供科學(xué)有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：型號(hào)e2695，Waters；電子天平：型號(hào)XS205DU，METTLER TOLEDO；超聲波清洗機(jī)：型號(hào)KQ-500DA，昆山市超聲儀器有限公司；蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，95.0%，110787- 201206；甲醇：色譜純，默克；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，純水制備系統(tǒng)為Millipore 公司生產(chǎn)，型號(hào)為Milli-Q。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取14.80 mg 蘆薈苷（中國食品藥品檢驗(yàn)研究院，95.0%，110787-201206）置于10 mL 容量瓶中，加入55%甲醇溶解混勻。準(zhǔn)確移取上述溶液1 mL 于25 mL 容量瓶中，用55%甲醇定容，搖勻待用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)溶液4 μL、6 μL、8 μL、10 μL 和13 μL，依次注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以蘆薈苷的量（ng）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值峰面積（A）為縱坐標(biāo)建立線性回歸方程。

1.2.3 樣品制備

將樣品混勻，準(zhǔn)確稱取1 g，置于50 mL容量瓶中，加55%甲醇適量超聲5 min，加55%甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾上機(jī)。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO C185.0 μm，4.6 mm×250 mm；柱號(hào)：AKAD09668；流動(dòng)相：55 ∶45（甲醇∶水）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：293 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2 數(shù)學(xué)模型

蘆薈苷含量計(jì)算公式如下：

式中：X為樣品中蘆薈苷含量，mg/kg；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的蘆薈苷的濃度，μg/mL；V為樣品最終定容體積，mL；m樣為樣品稱樣量，g。

3 測(cè)量不確定度來源分析

由圖1 知，樣品中蘆薈苷含量x的合成相對(duì)不確定度為：

圖1 保健食品中蘆薈苷的測(cè)定不確定度來源

4 不確定度分量的量化

4.1 樣品產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C樣)

4.1.1 樣品稱量引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

（1）天平的分辨力u1萬分之一的天平，天平的分辨力為0.1 mg，屬于均勻分布，不確定度為u1=0.29×0.000 1=0.000 029 g。

（2）天平的變動(dòng)性u(píng)2稱量的變動(dòng)性引入的不確定度，準(zhǔn)確至±0.000 1 g，按均勻分布不確定為因此蘆薈苷樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則其對(duì)樣品產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(m)=0.000 064 6。

4.1.2 樣品定容過程及樣品進(jìn)樣量所引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)

體積的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分量主要由容器體積的不確定度、容器和溶液溫度與校正溫度不同所引起的不確定度組成。

本次試驗(yàn)中樣品的定量總體積為50 mL，使用50 mL A 級(jí)量瓶定容，允許誤差分別為±0.05 mL[4]，按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為容量瓶和溶液溫度與校正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度，本次試驗(yàn)中的環(huán)境溫度與校準(zhǔn)時(shí)基本相同，此因素引起的不確定度可忽略不計(jì)。得出相對(duì)不確定度為：

4.2 對(duì)照溶液濃度C對(duì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel(Cs)

4.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

56.24 μg/mL 蘆薈苷對(duì)照溶液是由標(biāo)準(zhǔn)品（1 406 μg/mL）稀釋制得。不確定度來源包括對(duì)照品本身的不確定度、稀釋過程中不確定度和進(jìn)樣量引起的不確定度。

（1）天平的分辨力u1十萬分之一的天平，天平的分辨力為0.01 mg，屬于均勻分布，不確定度為u1=0.29×0.000 1=0.000 029 g

（2）天平的變動(dòng)性u(píng)2稱量的變動(dòng)性引入的不確定度，準(zhǔn)確至±0.000 01 g，按均勻分布不確定為因此蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為則其對(duì)標(biāo)準(zhǔn)系列產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(m標(biāo))=0.000 436。

4.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋時(shí)移液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C稀)

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量主要由容器體積的不確定度、容器充滿液體至其刻度的估讀誤差，以及容器和溶液溫度與校正溫度不同引起的不確定度組成。

稱取0.014 80 g 蘆薈苷標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，得到近148 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)使用液。稀釋過程使用1 mL 移液管吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，25 mL 容量瓶定容，得到混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。1 mL 移液管所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為容量瓶的最大允許誤差為±0.03 mL，按照均勻分布評(píng)定，則容量瓶和溶液溫度與校正時(shí)的溫度不同引起的體積不確定度，在本試驗(yàn)中環(huán)境溫度與校準(zhǔn)時(shí)相同，該因素引起的不確定度忽略不計(jì)。上述不確定度分量相互獨(dú)立，合成得：

將urel(m標(biāo))，urel(C稀)合成得urel(Cs)=0.004 12。

4.3 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求cx 時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(L)

按1.2.4 高效液相色譜儀的條件，測(cè)定蘆薈苷的峰面積，線性方程為A=ac+b=2.514 9c+1.801 3，r=1.000 0。將進(jìn)樣量ng 換算成進(jìn)樣體積為10 μL 時(shí)的濃度曲線分別為cx=55.16 μg/mL，方程為A=25.148 6c+1.801 3，不同濃度下蘆薈苷的峰面積如表1 所示，線性回歸法測(cè)量蘆薈苷不確定度計(jì)算過程如表2 所示。

表1 不同濃度下蘆薈苷的峰面積

表2 線性回歸法測(cè)量蘆薈苷不確定度計(jì)算過程

則標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制過程中，求cx時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(L)=0.012 2。

式中：u為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求cx時(shí)產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，μg/mL；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距；p為樣品溶液的測(cè)定次數(shù)；n為標(biāo)準(zhǔn)系列的測(cè)定次數(shù)；C—為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液蘆薈苷濃度的平均值，μg/mL；Ci為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液蘆薈苷的濃度，μg/mL；Ai為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的峰面積。

4.4 平行試驗(yàn)重復(fù)性引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)的計(jì)算

對(duì)樣品進(jìn)行了6 次重復(fù)測(cè)量，進(jìn)樣量10 μL，其測(cè)量結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3 所示。

由表3 可知，樣品6 次重復(fù)測(cè)量含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.003 1，則保健食品中蘆薈苷含量的測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)不確定度為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表3 樣品6 次重復(fù)測(cè)量結(jié)果

4.5 樣品中蘆薈苷含量檢測(cè)的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(x)的評(píng)定

高效液相色法測(cè)定保健食品中蘆薈苷含量的測(cè)量不確定度匯總見表4。

表4 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

代入公式（1）得到：

則蘆薈苷含量測(cè)量的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

4.6 擴(kuò)展不確定度的分析

取包含因子k=2（近似95%置信概率），則擴(kuò)展不確定度為：

擴(kuò)展不確定度是根據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子k=2 得到，其置信概率近似為95%，按近似于正態(tài)分布處理。

4.7 結(jié)果報(bào)告

5 結(jié)論

本文根據(jù)《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》（JJF 1135—2005）和《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）標(biāo)準(zhǔn)和不確定度文獻(xiàn)，結(jié)合本研究進(jìn)行高效液相色譜法測(cè)定保健食品中蘆薈苷含量的不確定度評(píng)定，按照實(shí)驗(yàn)過程選出不確定度的來源包括測(cè)量重復(fù)性、稱量、定容以及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制等過程。根據(jù)計(jì)算模型計(jì)算出各步驟的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量值，由最后結(jié)果可得知標(biāo)準(zhǔn)曲線所產(chǎn)生的不確定度最大，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)該盡量選擇準(zhǔn)確度較高的標(biāo)準(zhǔn)品、容量瓶和移液管來進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制，同時(shí)盡量使樣品中蘆薈苷的含量介于標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間部分。