鹽脅迫下褪黑素對小麥種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響

劉佳奇,李 麗,楊紅紅,孫 敏,馮漢青，2

(1. 西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2. 西北師范大學(xué)新農(nóng)村發(fā)展研究院，甘肅蘭州 730070)

據(jù)聯(lián)合國糧食安全署報告，世界上鹽漬化的土地面積約8.31×10hm，而我國鹽漬化土地有約3.6×10hm，主要分布在西北、東北和華北的干旱、半干旱地區(qū)。小麥是世界范圍內(nèi)廣泛種植的糧食作物之一，在我國常年種植面積和產(chǎn)量約占我國糧食總面積和總產(chǎn)量的25%和22%左右，小麥產(chǎn)量與我國糧食安全息息相關(guān)。相關(guān)研究表明，土壤中的鹽能夠影響種子萌發(fā)，引起植物體生理功能紊亂，導(dǎo)致植物幼苗生長減緩；損害葉綠體結(jié)構(gòu)，使葉綠素含量和氣孔導(dǎo)度降低，造成植物光合效率和蒸騰作用下降，最終造成小麥減產(chǎn)。因此，尋找增強小麥的耐鹽性方法，對其增產(chǎn)、增收具有重要意義。

褪黑素(melatonin，MT)是一種在動植物中廣泛存在的小分子物質(zhì)，為色氨酸吲哚類衍生物，具有很強的抗氧化作用，能促進植物側(cè)根的生長，延緩葉片衰老。褪黑素可通過增強抗氧化作用等途徑增強植物對干旱、鹽害、重金屬、高溫、冷害等多種逆境的抗性。研究表明，外源褪黑素能夠調(diào)節(jié)番茄的種子萌發(fā)和生長發(fā)育；緩解干旱脅迫對番茄幼苗光合性能的抑制，加強光合運轉(zhuǎn)效率；顯著緩解硝基苯酚脅迫對水稻幼苗生長、葉片PS Ⅱ光化學(xué)效率等產(chǎn)生的影響，提高水稻幼苗對硝基苯酚脅迫的適應(yīng)性。有關(guān)外源褪黑素對小麥耐鹽脅迫的效應(yīng)鮮見報道。

本試驗擬分析鹽脅迫對小麥種子萌發(fā)系數(shù)、幼根干重、鮮重、根長和幼根細胞死亡水平等指標的影響，探究在鹽脅迫下施用不同濃度褪黑素對小麥種子萌發(fā)和幼苗生理特性的效應(yīng)，為鹽堿地小麥的栽培提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為春小麥綿雜麥168。

1.2 試驗設(shè)計

培養(yǎng)液設(shè)置7個處理，分別為蒸餾水(CK)，100 mmol·LNaCl溶液(T)，T+5 μmol·L褪黑素溶液(T5)，T+50 μmol·L褪黑素溶液(T50)，T+100 μmol·L褪黑素溶液(T100)，T+150 μmol·L褪黑素溶液(T150)，T+250 μmol·L褪黑素溶液(T250)。選取大小均勻、顆粒飽滿的小麥種子，用0.1%的次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3～4次；在培養(yǎng)皿底部鋪墊用以上處理液充分浸濕的雙層濾紙，每皿均勻擺放已消毒的100粒小麥種子，每個處理重復(fù)4次；于恒溫培養(yǎng)箱中進行種子萌發(fā)和幼苗試驗，溫度為25 ℃，光照周期為 16 h光照/8 h黑暗，相對濕度70%。每日補充相應(yīng)處理溶液以保持培養(yǎng)皿中濾紙的濕度。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 種子萌發(fā)指標測定

培養(yǎng)2 d后開始統(tǒng)計小麥的發(fā)芽種子數(shù)(以胚根為種子長度的二倍左右為發(fā)芽標準)，每天統(tǒng)計一次，到第6 d為止。計算發(fā)芽率、發(fā)芽勢和相對耐鹽指數(shù)。

發(fā)芽勢=(日發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率=(6 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

相對耐鹽指數(shù)=(處理組發(fā)芽率/對照組發(fā)芽率)×100%。

1.3.2 幼苗生長指標測定

取培養(yǎng)4 d的小麥6株，用蒸餾水沖洗3～4次幼根；用吸水紙將表面水分吸干；測量小麥幼根和胚芽鞘長度；將幼苗分為根和地上部并分別稱鮮重；將其放入70 ℃的烘箱中24 h，烘干并稱重。重復(fù)4次。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù)和葉綠素含量的測定

將培養(yǎng)7 d的小麥幼苗取出。參照Flexas等和Hazrati等的方法，使用葉綠素熒光成像儀(ImagePAM)測定小麥幼苗的葉綠素熒光參數(shù)。具體測定步驟如下：連接儀器，儀器正常運行后測得暗適應(yīng)狀態(tài)的初始熒光()和最大熒光()，當所測材料在作用光下的實時熒光(Fs)達到穩(wěn)態(tài)(20 s)后打開飽和脈沖光，測得最大熒光(')，再打開遠紅外光，測最小熒光(')。測量結(jié)束后導(dǎo)出參數(shù)(光化學(xué)淬滅系數(shù))、ETR(PS Ⅱ光合電子傳遞速率)、NPQ和(非光化學(xué)淬滅系數(shù))，并計算/(PS Ⅱ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量)。

取培養(yǎng)7 d的小麥葉片，剪碎，放入研缽中，加入3 mL 80%( V/V) 的丙酮，研成勻漿，倒入5 mL離心管中，離心后，于 663 nm 和 645 nm 下測定吸光值，計算葉綠素含量。

1.3.4 根細胞死亡水平測定

根據(jù)Hung等的方法進行。將培養(yǎng)4 d的小麥幼根用蒸餾水清洗3～4次，室溫下浸泡于0.25%的伊文思藍染液中15 min；用蒸餾水反復(fù)清洗表面的伊文思藍染液至去除表面染料；將幼根切碎，放入5 mL 50%的甲醇和1%十二烷基磺酸鈉(SDS)的混合提取液中，50 ℃水浴1 h；檢測提取液在595 nm處的吸光值，以此來代表細胞死亡程度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和作圖；采用ANOVA和Duncan法進行方差分析和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對鹽脅迫小麥萌發(fā)指標的影響

由圖1可見，鹽脅迫(T)下，小麥種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽期相對耐鹽指數(shù)均較CK顯著降低。施用褪黑素可在不同程度上提高鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)指標，T100處理的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽期相對耐鹽指數(shù)較T處理顯著提高，分別提高了35.8%、7.8%、7.8%；表明添加100 μmol·L褪黑素能夠有效緩解鹽脅迫對小麥種子萌發(fā)的抑制作用。

圖柱上不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 褪黑素對鹽脅迫小麥幼苗生長指標的影響

由圖2可知，在100 mmol·LNaCl脅迫(T)下，小麥幼苗的生長受到了明顯的抑制，與CK相比，小麥的根長、胚芽鞘長、根的鮮重和干重均顯著降低。

與T處理相比，T5、T50、T100、T150處理的小麥根長顯著增加，分別增加了37.5%、33.8%、54.2%、61.7%，T250與T處理無顯著差異(圖2A)；T5、T50、T100、T150處理的胚芽鞘長顯著增加，分別增加了22.4%、25.7%、36.5%、 42.8%、21.7%(圖2B)。褪黑素濃度為150 μmol·L時對鹽脅迫引起的小麥根長和胚芽鞘抑制作用的緩解效果最佳。

與T處理組相比，T5、T50、T100、T150、T250處理根鮮重分別增加了41.1%、40.7%、77.4%、69.7%、19.3%(圖2C)；根干重分別增加了40.9%、47.3%、54.3%、60.2%、32.6%(圖2D)，差異均顯著。褪黑素濃度為100～150 μmol·L對鹽脅迫引起的小麥根鮮重和干重抑制作用的緩解程度最明顯。

從圖2E可以看出，與T處理相比，T5、T50、T100、T150、T250處理地上部干重分別增加了46.7%、47.3%、55.8%、48.9%、44.8%，差異均顯著。褪黑素濃度為100 μmol·L對鹽脅迫導(dǎo)致的小麥地上部干重抑制的緩解作用最顯著。

圖2 褪黑素對小麥幼苗生長的影響

2.3 褪黑素對鹽脅迫下葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

由圖3A、3B可以看出，相較于CK，100 mmol·LNaCl處理下小麥幼苗葉片和ETR顯著降低，分別減小了52.3%和35.4%。相較于T處理，T5、T50、T100、T150、T250處理的值分別增加29.1%、30.5%、47.4%、 48.1%和43.8%，ETR值分別增加13.3%、 22.7%、27.7%、28.9%和21.2%。結(jié)果表明，褪黑素能顯著緩解鹽脅迫下小麥幼苗葉片和ETR的下降，濃度為100～250 μmol·L時效果最好。

光化學(xué)淬滅系數(shù)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)存在此消彼長的相互競爭關(guān)系。由圖3C、3D可以看出，在NaCl處理下，伴隨著小麥幼苗葉片的降低，NPQ和顯著升高。相較于T處理，加入5、50、100、150、250 μmol·L褪黑素均使NPQ和顯著降低。由圖3E可以看出，相較于CK，T處理下，小麥幼苗葉片/顯著降低，相較于T處理，加入不同濃度褪黑素后均使得小麥幼苗葉片的/顯著升高。

圖3 褪黑素對小麥幼苗葉片葉綠素熒光參數(shù)的影響

2.4 褪黑素對鹽脅迫下葉片葉綠素含量的影響

由圖4可知，相較于CK，T處理下小麥幼苗葉片的葉綠素含量顯著下降(16.5%)。T150處理葉綠素含量較T處理提高了10.7%，表明添加150 μmol·L褪黑素可顯著促進鹽脅迫下葉綠素的合成，其他濃度對葉綠素合成的促進作用不顯著。

圖4 褪黑素對小麥幼苗葉片葉綠素含量的影響

2.5 鹽脅迫下褪黑素對小麥幼根細胞死亡的 影響

如圖5所示，與CK相比，T處理下小麥幼根細胞死亡水平顯著升高(36.2%)。與T處理相比，T100、T150和T250處理后根細胞死亡水平顯著降低，分別降低9.2%、7.0%和11.4%，T5和T50處理相較T處理無顯著差異。結(jié)果表明，外源褪黑素在100～250 μmol·L時能夠有效緩解鹽脅迫對小麥幼根細胞的損傷。

圖5 褪黑素對小麥幼根細胞死亡的影響

3 討 論

種子萌發(fā)是植物能夠生長的首要條件。本研究結(jié)果表明，100 mmol·LNaCl處理對小麥種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，而適宜濃度的褪黑素對鹽脅迫下小麥種子的萌發(fā)具有一定緩解作用。這與張 娜等發(fā)現(xiàn)的在鹽脅迫下施加褪黑素能夠顯著提高狼尾草種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率的報道的結(jié)果一致。褪黑素的這種作用可能與褪黑素能夠解除鹽脅迫對種子萌發(fā)過程中的關(guān)鍵酶和滲透性物質(zhì)的抑制作用有關(guān)，但具體機制有待進一步研究。

生物量是植物在逆境環(huán)境下生長發(fā)育的關(guān)鍵指標。施加褪黑素能夠使小麥苗期生物量相關(guān)指標得以升高。這與在燕麥以及在扁穗雀麥中的研究結(jié)果一致。植物生長過程中的物質(zhì)積累主要是通過光合作用以及根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。鹽脅迫通過影響光合及根系細胞活力而抑制植物的生長。因此，研究褪黑素對鹽脅迫下植物光合和細胞活力的效應(yīng)有重要 意義。

PS Ⅱ是逆境脅迫下光合機構(gòu)受到損傷的原初位點之一，其光化學(xué)水平的變化代表著逆境中植物光合作用的變化。而葉綠素熒光參數(shù)作為反映PS Ⅱ光化學(xué)活性的靈敏探針，能夠準確的反應(yīng)逆境對PS Ⅱ的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，100 mmol·LNaCl處理下，小麥葉片、ETR和/顯著下降，和NPQ顯著升高，表明在鹽脅迫下小麥葉片光合電子傳遞受阻，對光能的吸收和運行效率降低，光合色素將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的能力降低，以非輻射形式損耗的能量增加；而加入褪黑素能夠顯著緩解、ETR和/的下降、和NPQ的升高，這表明褪黑素能夠維持鹽脅迫下PS Ⅱ的光化學(xué)活性，促進PS Ⅱ?qū)⒐饽苻D(zhuǎn)變成化學(xué)能，進而有效的緩解鹽脅迫對PS Ⅱ的抑制作用，提高小麥的耐鹽性。這與王芳等發(fā)現(xiàn)外源褪黑素能夠改善鹽脅迫下玉米幼苗的光合作用相一致。

在一定程度上葉綠素含量直接反應(yīng)光合作用的強弱。大量研究表明，NaCl脅迫對植物生長和生理特性產(chǎn)生負面影響，導(dǎo)致淺綠色癥狀，幼苗生長發(fā)育遲緩，損傷葉綠體的超微結(jié)構(gòu)，葉綠素含量降低，而且鹽脅迫后葉綠體會產(chǎn)生大量的ROS，使葉綠體蛋白合成受阻，從而影響葉綠體的發(fā)育和光合作用。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素濃度150 μmol·L時顯著緩解了NaCl處理下葉綠素含量的降低。推測這是由于褪黑素促進葉片光合作用所致，葉綠素熒光參數(shù)的改變可能與葉綠素含量變化密切相關(guān)。100 mmol·LNaCl能夠顯著地損傷小麥幼根細胞，而褪黑素濃度達到100 μmol·L以上時能夠顯著緩解鹽脅迫對小麥幼根細胞的損傷，提示了褪黑素能夠保護小麥的幼根細胞。Liang等研究也表明，褪黑素能夠有效減輕細胞損傷，從而延緩水稻葉片損傷，提高水稻的耐鹽性。

在小麥幼苗生長過程中，根系是最先接觸到鹽脅迫的器官，鹽脅迫導(dǎo)致小麥幼根細胞死亡水平上升，影響小麥幼苗對水分和物質(zhì)的吸收和運輸能力。隨著過多的鹽離子進入到小麥葉片中，光化學(xué)反應(yīng)也受到抑制，進而減少在植物進行光合作用的能力，導(dǎo)致小麥的生長和物質(zhì)積累受到了抑制。研究表明，褪黑素具有延阻細胞死亡、調(diào)節(jié)離子平衡、調(diào)控多種抗鹽相關(guān)基因表達的功能。推測褪黑素可能通過多種方式降低了鹽脅迫對于小麥生長、葉綠素合成、光合和細胞活力的不利影響，提高了小麥對于鹽脅迫的抗性。

綜上，100 mmol·LNaCl脅迫會顯著抑制小麥種子萌發(fā)和幼苗生長，降低小麥葉片葉綠素含量和光合效率，損傷幼根細胞；適宜濃度的褪黑素處理可有效緩解鹽脅迫對小麥生長抑制和細胞損傷程度，以100～150 μmol·L褪黑素的緩解效果最為明顯。因此，施加外源褪黑素有望成為緩解鹽脅迫對小麥不利影響的有效方法，但其具體作用機制還需進一步研究。