油菜葉片性狀及次生代謝物質(zhì)與其對黃寬條跳甲抗性的關(guān)系及對跳甲解毒酶活性的影響

郝江寧, 常 靜, 李 妍, 馮建雄, 李海平

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學園藝與植物保護學院, 呼和浩特 010019)

植物外部形態(tài)特征對害蟲取食具有深遠的影響,植食性昆蟲對寄主植物的發(fā)現(xiàn)和選擇包括定向和定位兩個行為過程,昆蟲的觸覺和味覺對其定位和取食選擇寄主植物起主要作用,寄主植物的外部形態(tài)及揮發(fā)性物質(zhì)在植食性昆蟲對寄主植物的定向過程中起著關(guān)鍵性作用[1]。

植物葉片表皮蠟質(zhì)是植物地上部分與外部環(huán)境的分界線,在植物對病原物的有效防御機制中,表皮蠟質(zhì)被認為是第一道防線[2]。植物葉片上的蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)影響葉片表面的光滑程度,蠟質(zhì)含量對葉片顏色也會產(chǎn)生一定的影響,從而影響植食性昆蟲的寄主選擇。Bodnaryk發(fā)現(xiàn)蔬菜黃條跳甲Phyllotretacruciferae對光滑卷心菜的為害遠大于非光滑型卷心菜[3]。茸毛是植物葉部形態(tài)特征之一,茸毛的密度和長短對昆蟲附著、取食和產(chǎn)卵有重大的影響。劉奕清等研究茶樹葉片茸毛對側(cè)多食跗線螨Polyphagotarsonemuslatus的抗性機制,發(fā)現(xiàn)茶樹葉片茸毛所形成的機械屏障,使側(cè)多食跗線螨的口針長度達不到取食部位[4]。對蚜蟲有抗性的高粱葉片表面茸毛稀且較長[5]。植物的茸毛結(jié)構(gòu)是否能夠表現(xiàn)出抗蟲性并不是絕對的。

植物次生物質(zhì)的種類和含量與植物抗蟲性也密切相關(guān)。目前已知與植物抗蟲性相關(guān)的植物次生代謝物質(zhì)包括生物堿、酚類、萜烯類等[6]。植物次生代謝物質(zhì)具有毒殺、驅(qū)避昆蟲、使其拒食、抑制昆蟲生長發(fā)育等作用。張永軍等發(fā)現(xiàn),棉花的次生代謝物質(zhì)縮合單寧能抑制棉鈴蟲Helicoverpaarmigera的生長發(fā)育和取食,并對許多刺吸式口器害蟲有明顯抗蟲效果[7]。陳巨蓮等發(fā)現(xiàn),抗蟲性小麥品種中單寧酸、總香豆素是其抗麥長管蚜Sitobionmiscanthi的主要次生代謝物質(zhì)[8]。野生番茄含有的黃酮類化合物可以減少植食性昆蟲對葉片的損傷[9-10]。番茄中含有的黃酮對煙粉虱Bemisiatabaci產(chǎn)卵有一定抑制作用,黃酮類含量高的品種對煙粉虱有驅(qū)避作用[11]。植物次生代謝物質(zhì)可以防御植食性昆蟲的為害,在植物抗蟲機制中起著重要的作用。另一方面,植食性昆蟲在與植物的協(xié)同進化中形成了以抗氧化酶和解毒酶為基礎(chǔ)的代謝機制,應(yīng)對各種生物脅迫,維持正常的生長發(fā)育和繁殖[12]。但關(guān)于這些物質(zhì)對甲蟲類的影響研究報道很少。

黃寬條跳甲Phyllotretahumilis是春油菜苗期的主要害蟲,對油菜生產(chǎn)危害很大。作者在前期研究中已經(jīng)篩選出了2個對黃寬條跳甲有抗性的油菜品種‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’,1個感蟲品種‘青油14’。在此基礎(chǔ)上,本研究主要檢測了這幾個油菜品種葉片性狀及次生代謝物質(zhì)在對黃寬條跳甲抗蟲性中的作用及對黃寬條跳甲解毒酶活性的影響,為未來油菜抗蟲育種研究提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試油菜

本試驗共選用3個油菜品種,分別為甘藍型油菜Brassicanapus‘青油14’和‘太空蒙Ⅳ’,芥菜型油菜B.juncea‘大黃油菜’。實驗室前期研究工作已經(jīng)明確‘太空蒙Ⅳ’與‘大黃油菜’為抗黃寬條跳甲品種,‘太空蒙Ⅳ’的抗蟲性高于‘大黃油菜’;‘青油14’為感蟲品種。

選取健康、飽滿的3個品種油菜種子,分別均勻播種于花盆中(直徑20 cm)。每盆播種20粒種子。出苗2周后取樣。

1.2 供試蟲源

黃寬條跳甲成蟲采自內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣哈樂鎮(zhèn)十字花科雜草獨行菜Lepidiumapetalum上。黃寬條跳甲成蟲越冬結(jié)束后,首先選擇發(fā)芽較早的獨行菜為害,當油菜出苗后轉(zhuǎn)移到油菜上為害。

1.3 試劑及藥品

沒食子酸標準品，α-乙酸萘酯(α-NA)，α-萘酚，固藍B鹽，毒扁豆堿，牛血清白蛋白(BSA)， 1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)，還原型谷胱甘肽(GSH)，Macklin 公司；蘆丁標準品和荷葉堿標準品，Sigma化學試劑公司；考馬斯亮藍G-250，F(xiàn)luka 公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 油菜幼苗葉片含水量和蠟質(zhì)含量測定

油菜葉片含水量測定參照薛俊杰的方法[13]。分別選取3個油菜品種的新鮮幼苗葉片各1 g,放入事先稱重的培養(yǎng)皿中,置于80℃烘箱內(nèi)迅速殺青至重量不再變化,稱重后減去培養(yǎng)皿重則為葉片干重,每品種重復3次,以單位鮮葉重計算葉片含水量。

蠟質(zhì)含量測定參照 Bewick等的方法[14]。分別選取3個油菜品種新鮮幼苗葉片5 g,置于燒杯中,倒入80 mL三氯甲烷浸泡葉片1 min,取出葉片后將溶液置于事先稱重的蒸發(fā)皿中,在通風柜中使三氯甲烷自然揮發(fā)完畢且蒸發(fā)皿恒重后稱量, 稱量后所得數(shù)值減去蒸發(fā)皿重量即為蠟質(zhì)重量,每品種重復3次,以單位鮮葉重計算蠟質(zhì)含量。

1.5 油菜葉片茸毛密度及長度的測定

選取出苗2周的3個品種油菜最頂端葉片各10片,使用奧林巴斯(OLYMPUS) CX21型生物顯微鏡觀察油菜葉片正反面表面茸毛。參照郭廣君等的方法[15]測定油菜葉片葉脈兩側(cè)對稱位置單位面積下的茸毛數(shù)量,計算茸毛密度。同時測量茸毛長度。

1.6 油菜次生代謝物含量測定

油菜可溶性單寧含量測定采用Folin-Ciocalteu法[16]。取3個品種油菜葉片各0.5 g制備單寧提取液。吸取0.5 mL提取液置于10 mL試管中,先加入2.5 mL 10倍福林酚稀釋溶液,再加入2 mL 7.5%碳酸鈉溶液,搖勻,靜置30 min,在760 nm處測定吸光度。用單寧酸制作標準曲線,計算可溶性單寧含量。

總酚測定采用Folin-Ciocalteu比色法(FC酚法)[17]。稱取3個品種油菜葉片各0.5 g,研磨后放入預冷離心管中,加入0.1 mL 10%三氯乙酸,加無水乙醇定容至5 mL,靜置30 min,5 000 g下離心10 min,取上清液待用。取乙醇提取液0.5 mL于25 mL容量瓶中,加入9.5 mL蒸餾水,搖勻,加入FC試劑0.5 mL混勻,在0.5～8 min內(nèi)加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液,充分混合后定容,30℃避光放置0.5 h,760 nm下測定吸光度,以蒸餾水為空白對照。每個樣品平行測3次。以沒食子酸為標準品,制作標準曲線。

黃酮含量的測定參考王金亭等的方法[18]。將油菜幼苗放入60℃烘箱中干燥5 h后研磨成粉末,稱取油菜粉末10 g加入70 mL 95%乙醇,在60℃超聲120 min,靜置過夜,過濾后用石油醚作溶劑萃取2次,除去脂溶物。除脂后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,用40%乙醇定容至100 mL。準確稱取2 mL樣品液到10 mL具塞試管中,加入40%乙醇溶液約3 mL 及5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻。放置5 min 后加入10%硝酸鋁0.3 mL,搖勻;5 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL及蒸餾水0.4 mL,搖勻;放置15 min,于510 nm波長下測定吸光度,每個樣品平行測3次。以蘆丁制作標準曲線,計算黃酮的含量。

生物堿的測定參考蔡永萍的方法[19]。將油菜幼苗放入60℃烘箱中干燥5 h后研磨成粉末。油菜粉末用40%乙醇進行超聲波提取,溫度為50℃,料液比1∶25(g/mL),提取時間為75 min。取2 mL樣品溶液于5 mL容量瓶,加三氯甲烷定容至5 mL,振搖,移至分液漏斗中,準確加入溴甲酚綠緩沖液和0.2 mol/L NaOH各1 mL,搖勻,靜置,取澄清的三氯甲烷萃取液在415 nm波長處進行測定,每個樣品平行測3次。以荷葉堿為標準品制作標準曲線。

1.7 黃寬條跳甲解毒酶活性測定

黃寬條跳甲羧酸酯酶活性的測定參考Van Asperen 的方法[20]。黃寬條跳甲從田間采回后在實驗室用不同品種油菜至少飼養(yǎng)2周。取黃寬條跳甲成蟲20頭,加入預冷的0.04 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液1 mL勻漿,勻漿液于4℃,12 000 r/min 離心20 min,取上清液作為酶源備用。根據(jù)預試驗結(jié)果,用預冷的0.04 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液稀釋酶液,向每個試管中依次加入0.9 mL預冷的0.04 mol/L磷酸緩沖液,3.6 mL 3×10-4mol/Lα-乙酸萘酯(含與α-乙酸萘酯1∶1的毒扁豆堿),以及0.1 mL酶液,對照加入緩沖液,30℃水浴振蕩反應(yīng)30 min,加入1.8 mL顯色劑終止反應(yīng)。室溫下靜置5 min。于600 nm處測其吸光度,重復3次。用α-萘酚制作標準曲線,計算羧酸酯酶的比活力。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測定采用Habig等的方法[21]。每處理取黃寬條跳甲成蟲20頭(來源同羧酸酯酶),加入預冷的0.02 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液1 mL冰浴勻漿,勻漿液于4℃、12 000 r/min離心15 min,上清液即為酶源?；钚詼y定時依次加入0.2 mL 0.03 mol/L谷胱甘肽,0.2 mL 0.03 mol/L CDNB,2 mL 0.02 mol/L磷酸緩沖液,0.15 mL酶液(對照用緩沖液代替)。立即混勻,340 nm下測定5 min內(nèi)吸光度變化值,計算谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的比活力。

1.8 蛋白質(zhì)含量測定

參照Bradford的考馬斯亮藍G-250法[22]。以牛血清白蛋白制作標準曲線,計算樣品中蛋白質(zhì)含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理均在Excel 2016中計算。試驗結(jié)果采用One-way ANOVA with Dunnett’s post test方法進行多重比較,處理與對照之間的差異顯著性采用t測驗,顯著水平設(shè)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個品種油菜幼苗葉片含水量和蠟質(zhì)含量

‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’葉片含水量顯著高于‘青油14’(表1)。‘大黃油菜’蠟質(zhì)含量顯著高于其他2個品種,‘太空蒙Ⅳ’和‘青油14’的蠟質(zhì)含量無顯著差異。

表1 3個春油菜品種葉片含水量和蠟質(zhì)含量1)Table 1 Water and wax contents in leaves of three spring rape varieties

2.2 3個油菜品種葉片茸毛密度和長度

3個油菜品種葉片正反兩面茸毛密度和長度均有顯著差異(表2)?！簏S油菜’茸毛密度最大,長度最長;‘青油14’次之,‘太空蒙Ⅳ’最小。

表2 3個春油菜品種葉片正反面茸毛密度和長度Table 2 Pubescence density and length on front and back sides of leaves of three spring rape varieties

2.3 3個油菜品種葉片4種次生代謝物質(zhì)的含量

3個油菜品種幼苗葉片4種次生代謝物質(zhì)含量見圖1。3個品種間單寧含量無顯著差異。‘太空蒙Ⅳ’的生物堿含量(59.5 μg/g)顯著高于‘青油14’(56.4 μg/g),而‘大黃油菜’生物堿含量(57.6 μg/g)和‘太空蒙Ⅳ’‘青油14’相比無顯著差異。‘太空蒙Ⅳ’總黃酮含量為0.33 mg/g,‘大黃油菜’總黃酮含量為0.31 mg/g,二者之間沒有顯著差異;‘太空蒙Ⅳ’與‘大黃油菜’的總黃酮含量顯著高于‘青油14’(0.24 mg/g)。3個品種油菜總酚含量與黃酮類似,‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’顯著高于‘青油14’,‘大黃油菜’和‘太空蒙Ⅳ’間無顯著差異。

圖1 3個春油菜品種葉片4種次生代謝物質(zhì)含量Fig.1 Contents of four secondary metabolites in leaves of three spring rape varieties

2.4 取食不同品種油菜后黃寬條跳甲2種解毒酶活性的差異

圖2表示黃寬條跳甲取食3種油菜后2種解毒酶活性的變化。其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性差異很大,3個品種間有極顯著差異(P<0.01),但羧酸酯酶(CarE)活性無顯著差異(P>0.05)。

圖2 取食3個春油菜品種后黃寬條跳甲2種解毒酶活性Fig.2 Activities of two detoxifying enzymes of Phyllotreta humilis feeding on three spring rape varieties

3 結(jié)論與討論

植物葉片的形態(tài)特征對植食性昆蟲的取食影響很大。葉片上的茸毛可以作為抗蟲因子干擾昆蟲產(chǎn)卵及其對植物的附著和取食,也可以作為保護植物免受外界不利因素干擾的屏障。王艷秋等研究Q型煙粉虱BemisiatabaciQ-biotype對煙草品種的選擇性[23],李德偉等在油茶對茶黃薊馬Scirtothripsdorsalis的抗性研究[24]中均發(fā)現(xiàn)植物葉背茸毛密度低的品種抗蟲性較強。植物葉片光滑不利于昆蟲附著為害,相反,昆蟲更容易在葉表茸毛多的品種上附著、取食和產(chǎn)卵。本試驗也發(fā)現(xiàn),不同抗蟲油菜品種,其葉片茸毛密度存在差異,‘太空蒙Ⅳ’抗蟲性最強,其茸毛密度最小。但王麗麗等發(fā)現(xiàn),葡萄葉片茸毛密度和葡萄對綠盲蝽Apolyguslucorum的抗性沒有顯著相關(guān)性[25]。綜上所述,植物葉片茸毛密度對植物抗蟲性的影響可能與昆蟲種類、口器、取食部位等有關(guān),不同種類的害蟲,其為害方式和口器不同,都可能導致對植物茸毛密度反應(yīng)的差異,在抗蟲性研究中應(yīng)分別對待。另外,植物葉片茸毛長度對其抗蟲性也有一定的影響。常金華等研究高粱對蚜蟲的抗性機制時發(fā)現(xiàn)，高感蚜材料表面茸毛密度大但長度短,抗蚜材料‘河農(nóng)16’茸毛密度小,長度大[5]。本試驗結(jié)果表明,‘太空蒙Ⅳ’的正反面茸毛密度和長度都顯著小于其他2個品種,抗蟲性最好。但同為抗蟲品種的‘大黃油菜’無論是茸毛長度還是密度均與‘太空蒙Ⅳ’存在顯著差異,可能是由于‘大黃油菜’屬于芥菜型,而‘太空蒙Ⅳ’‘青油14’屬于甘藍型。不同類型的油菜其茸毛密度和長度不同,推測芥菜型‘大黃油菜’抗蟲性可能與植物表面茸毛沒有特定關(guān)系,僅與植物次生代謝物質(zhì),防御酶、營養(yǎng)物質(zhì)等密切相關(guān)。

水是植物和昆蟲生存的條件,參與植物及昆蟲體內(nèi)的各種生理代謝。鄭文靜等研究水稻主要養(yǎng)分對灰飛虱Laodelphaxstriatellus取食選擇性的影響,發(fā)現(xiàn)水稻含水量與灰飛虱的選擇負相關(guān)[26]。薛俊杰研究發(fā)現(xiàn),水稻對稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的抗蟲性隨葉片含水量減少而增強,水稻葉片含水量與其抗蟲性具有負相關(guān)性[13]。而曾糧斌等在研究苧麻葉片主要化學成分與其抗苧麻夜蛾Cocytodescoerulea的關(guān)系時發(fā)現(xiàn),葉片含水量與抗蟲性沒有明顯的相關(guān)性[27]。本研究發(fā)現(xiàn),不同品種油菜含水量差異顯著,‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’葉片含水量高抗蟲性強，而‘青油14’葉片含水量低抗蟲性弱，油菜葉片含水量高可能對黃寬條跳甲抗性強，但還需要進一步確定。由于不同品種植物、昆蟲體內(nèi)含水量不同,植物含水量對抗蟲性的影響可能因植物種類和昆蟲種類而異。油菜在內(nèi)蒙古西部主要種植在干旱少雨地區(qū),因而油菜葉片含水量高抗逆性相對較強,所以抗蟲性也相對較高。但關(guān)于含水量對油菜抗黃寬條跳甲的影響還需要做進一步深入研究。

植物葉片表面的蠟質(zhì)含量與其抗蟲性緊密相關(guān)[28]。 Bodnaryk等研究十字花科植物葉片蠟質(zhì)與蔬菜黃條跳甲的取食關(guān)系,結(jié)果表明，葉片具有蠟質(zhì)層的植物可以更好地抵御蔬菜黃條跳甲的為害[3]。王亓翔等的研究表明,水稻葉片蠟質(zhì)含量高對稻縱卷葉螟的抗性強[29]。Bergman等認為,蠟質(zhì)數(shù)量的增加會增強紫花苜蓿對苜蓿彩斑蚜Therioaphismaculatus的抗性[30]。本研究結(jié)果表明,‘大黃油菜’葉片蠟質(zhì)含量顯著高于其他兩個品種,與他們的研究結(jié)果一致。但抗蟲性更強的‘太空蒙Ⅳ’卻與非抗蟲品種‘青油14’的蠟質(zhì)含量相近,且無顯著差異,可能是因為‘太空蒙Ⅳ’和‘青油14’都屬于甘藍型油菜,蠟質(zhì)含量相對芥菜型油菜較低,抗蟲性與其葉片蠟質(zhì)含量沒有直接關(guān)系。很多研究也表明植物葉片蠟質(zhì)含量與抗蟲性無關(guān)[15,31]。植物抗蟲性除與葉片蠟質(zhì)含量有關(guān)外,和蠟質(zhì)的化學成分、結(jié)構(gòu)等也有關(guān)系,而且蠟質(zhì)可能與其他因素一起對植物抗蟲性起作用。

植物在與害蟲的長期協(xié)同進化過程中,為了防御害蟲的侵害,會產(chǎn)生一些對害蟲不利的次生代謝物質(zhì)。王麗艷等的研究發(fā)現(xiàn),抗蟲水稻品種次生物質(zhì)含量顯著高于感蟲水稻品種[32]。Demissie等發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)含量高的玉米品種受麥蛾SitotrogacerealellaOlivier為害程度減輕[33]。單寧是植物產(chǎn)生的最豐富的次生代謝物,其分子結(jié)構(gòu)上的羥基能和其他蛋白質(zhì)上的羥基結(jié)合使昆蟲消化酶活性降低,影響植食性昆蟲對食物的利用。辣椒葉片中單寧含量與辣椒對西花薊馬Frankliniellaoccidentalis的抗性呈正相關(guān)[34]。左彤彤等的研究發(fā)現(xiàn),不同地理源的紅松球果和韌皮部的單寧、黃酮和總酚含量不同,3種次生物質(zhì)含量與其受到球果尺蛾Eupitheciaabietaria和果梢斑螟Dioryctriapryeri的為害率呈現(xiàn)負相關(guān)[35]。單寧能與昆蟲唾液蛋白和消化酶結(jié)合,降低植物適口性,阻礙昆蟲對寄主植物營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[36]。本研究中,抗蟲品種‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’的總酚和黃酮含量顯著高于感蟲品種‘青油14’,‘太空蒙Ⅳ’總生物堿含量顯著高于感蟲品種‘青油14’。單寧的含量也是‘太空蒙Ⅳ’>‘大黃油菜’>‘青油14’。這些研究結(jié)果說明,植物次生代謝物質(zhì)含量與植物抗蟲性之間有直接的關(guān)系,植物次生代謝物質(zhì)的含量,在一定程度上可以反映植物的抗蟲性水平。

另一方面,植食性昆蟲為分解代謝植物體內(nèi)的物質(zhì)和外源有毒物質(zhì),形成特有的解毒代謝機制,這是昆蟲與所取食植物長期共同進化的結(jié)果。昆蟲通過調(diào)節(jié)體內(nèi)解毒酶活性來代謝次生代謝物質(zhì),解毒酶活性的變化是昆蟲一種主動的適應(yīng)機制[37-38]。陳德霞等在研究牧草次生代謝物對亞洲小車蝗Oedaleusasiaticus解毒酶活性影響中發(fā)現(xiàn),取食次生代謝物質(zhì)(黃酮、生物堿、萜類、酚類和單寧)含量高的牧草,亞洲小車蝗解毒酶活性高,取食次生代謝物質(zhì)含量低的亞洲小車蝗解毒酶活性也低[12]。牟少飛等研究B型煙粉虱B.tabacibiotype B發(fā)現(xiàn),食物中低劑量的槲皮素會導致煙粉虱CarE和GST的活性顯著升高[39]。本試驗中,黃寬條跳甲取食3個不同品種油菜后2種解毒酶活性有差異。黃寬條跳甲取食‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’2個抗蟲品種后GSTs的活性高于取食‘青油14’,三者間有極顯著差異。黃寬條跳甲取食2個抗蟲品種油菜后CarEs活性比取食感蟲品種油菜的CarEs活性高,但差異不顯著。這一試驗結(jié)果可能與不同品種油菜次生代謝物質(zhì)含量不同有關(guān),抗蟲品種油菜‘太空蒙Ⅳ’和‘大黃油菜’的4種次生代謝物質(zhì)含量都高于感蟲品種‘青油14’。黃寬條跳甲取食不同含量次生代謝物質(zhì)的油菜后,通過調(diào)節(jié)2種解毒酶活性來完成解毒代謝。

油菜是我國最重要的油料作物之一,近幾年主要面臨生產(chǎn)成本高、種植效益低的問題[40],病蟲害的危害加劇也給油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展帶來一定的不利條件[41]。研究油菜對苗期主要害蟲黃寬條跳甲的抗性機制,減少害蟲為害帶來的損失,同時減少化學農(nóng)藥的使用,降低生產(chǎn)成本,對未來油菜的綠色可持續(xù)發(fā)展具有一定的科學指導意義。