補(bǔ)陽還五湯對(duì)脊髓損傷大鼠磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白通路及神經(jīng)功能影響※

李 江 潘 樂 雍 晨 劉 闖 譚龍旺

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱病區(qū)，陜西 咸陽 712000)

應(yīng)用中藥治療脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)可以取得顯著療效，且不良反應(yīng)少，越來越受到學(xué)者的關(guān)注，但其分子生物學(xué)機(jī)制尚未明確。目前大眾最常研究的是SCI發(fā)生后某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活，使脊髓神經(jīng)元具有一定有限的自我修復(fù)和再生功能，來促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。補(bǔ)陽還五湯作為益氣活血通絡(luò)名方，臨床及文獻(xiàn)報(bào)道治療SCI有良好的療效。本實(shí)驗(yàn)通過觀察補(bǔ)陽還五湯對(duì)大鼠SCI后大鼠神經(jīng)細(xì)胞巢蛋白(Nestin)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號(hào)通路活性的影響，以及在該信號(hào)通路被特異性阻斷劑雷帕霉素抑制的情況下，補(bǔ)陽還五湯是否還可以發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，以揭示補(bǔ)陽還五湯參與促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康6個(gè)月齡雌性SD大鼠96只，體質(zhì)量250～300 g,實(shí)驗(yàn)前大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2018-0032，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)濕度40%～70%，溫度26 ℃，晝夜12 h間斷照明。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 補(bǔ)陽還五湯濃縮液藥物組成(由陜西中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備)：黃芪120 g，當(dāng)歸6 g，川芎4.5 g，赤芍4.5 g，地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，加工成4 g/mL濃度藥液，無菌封瓶，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。雷帕霉?美國(guó)Sigma公司)、注射用青霉素鈉(成都倍特藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H13021731)、10%水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

總RNA提取試劑盒、RNA RT-PCR試劑盒(一步法)(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)；蛋白激酶B單克隆抗體(Akt)、抗mTOR小鼠單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology 公司)；兔抗-巢蛋白(Nestin)多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)、兔抗β-Actin多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記親和純化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG)二抗；蛋白酶和磷酸酶抑制劑(北京諾為生物技術(shù)有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、RIPA裂解液(強(qiáng))、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)(美國(guó)Millipore公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 Centrifuge 5424R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf 公司)；Mini-protean 3 cell電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Tanon-5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及造模 96只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組、阻斷組4組，每組24只。除正常組外，其余各組均采用改良Allen法建立SCI大鼠模型，用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，背部皮膚備皮，以胸椎(T)8～9棘突為中心，逐層切開，將T8～9部分棘突及椎板去除，顯露硬膜，將10 g砝碼從2.5 cm高處自由落下，擊中硬膜和脊髓組織，造成局部SCI模型。建模成功標(biāo)志為出現(xiàn)大鼠尾巴擺動(dòng)痙攣、下肢麻痹。大鼠造模后分籠單籠飼養(yǎng)；術(shù)后保暖，人工按摩大鼠膀胱每日2次至能自主排尿；術(shù)后1周內(nèi)前肢肌肉注射注射用青霉素鈉8×104U，每日1次。

1.4.2 給藥 補(bǔ)陽還五湯組于術(shù)后第2天用4 g/mL濃度的補(bǔ)陽還五湯濃縮液灌胃，每日2次，每次灌胃劑量按人60 kg體質(zhì)量每日1劑換算，大鼠等效用藥劑量約為0.217 g/kg(分2次灌胃)，連續(xù)灌胃3周。阻斷組在補(bǔ)陽還五湯給藥基礎(chǔ)上于術(shù)后第2天予雷帕霉素3 mg/kg，每日1次腹腔注射，連續(xù)3周。正常組、模型組術(shù)后予等容積0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃3周。

1.5 觀察指標(biāo) 為排除實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偶然性，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠程度，取材檢測(cè)過程中每組隨機(jī)抽取6只大鼠。術(shù)后3周各組分別隨機(jī)選取6只大鼠，評(píng)定大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能后，處死大鼠，以損傷區(qū)為中心取2 cm脊髓組織，縱切等分后置于液氮中，用于檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠神經(jīng)細(xì)胞Nestin，以及通路中Akt、mTOR的蛋白和mRNA表達(dá)水平。

1.5.1 聯(lián)合行為評(píng)分(CBS) 用于評(píng)定大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況，包括：開放空間運(yùn)動(dòng)、觸地反應(yīng)、腳趾伸展、回縮反應(yīng)、斜板試驗(yàn)、端正體位和游泳等[1]。評(píng)分值：正常0分，全癱100分。

1.5.2 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)Nestin、Akt、mTOR蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液，加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑裂解脊髓組織。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，收集上清液并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。每孔8 μg的總蛋白樣品經(jīng)濃度為5%～17% SDS-聚丙烯胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)入PVDF膜(0.45 μmol/L)，將膜用2%的封閉蛋白干粉室溫封閉2 h后，分別加Nestin、p-Nestin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR(Ser2448)(1∶1000)、β-actin(1∶400)一抗4 ℃孵育過夜，經(jīng)磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗3次后加HRP標(biāo)記的二抗(1∶5000)37 ℃孵育2 h。經(jīng)PBST充分漂洗后，目的蛋白信號(hào)由增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)并曝光于X線片上。采用Western blot半定量分析Nestin、p-Nestin、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR(Ser2448)，其中p-Akt、p-mTOR的相對(duì)光密度表達(dá)為各條帶的累積光密度比相應(yīng)的Akt、mTOR的累積光密度，其相對(duì)光密度表達(dá)為每條帶的累積光密度比相應(yīng)的β-actin。

1.5.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA表達(dá) 脊髓組織液氮中勻漿后，RNA 提取試劑盒提取總RNA，將提取的總RNA(8 μL)加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合(共20 μL)，合成cDNA。實(shí)驗(yàn)樣品總RNA的提取及RT-PCR的操作步驟均按照試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)條件設(shè)定如下：①Nestin：40℃ 30 min、90℃ 5 min、5℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 min；90 ℃變性30 s，50℃退火30 s，73℃延伸30 s，20個(gè)循環(huán)；70℃ 10 min。②Akt:40℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；96℃ 5 min；93℃變性35 s，55 ℃退火30 s，74℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)；75℃ 10 min。③mTOR:45℃ 30 min、95℃ 5 min、5℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；93 ℃ 5 min；94℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸 30 s,共25個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)完成后，采用Tanon-2500全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)將凝膠結(jié)果錄入電腦，采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA與β-actin mRNA的比值，作為各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CBS比較 補(bǔ)陽還五湯組CBS低于模型組、阻斷組(P<0.05)。模型組、阻斷組CBS組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠CBS比較 分，

2.2 各組大鼠Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)，Nestin表達(dá)增加但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，補(bǔ)陽還五湯組、阻斷組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均升高(P<0.05)，阻斷組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯升高或降低(P>0.05)；與補(bǔ)陽還五湯組比較，阻斷組Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組大鼠Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖1 各組大鼠Nestin、Akt、mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 各組大鼠Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量比較 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量均升高(P<0.05)，Nestin mRNA相對(duì)含量增加，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，補(bǔ)陽還五湯組、阻斷組Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量均升高(P<0.05)；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量均升高(P<0.05)，阻斷組3種Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量無明顯升高或降低(P>0.05)；與補(bǔ)陽還五湯組比較，阻斷組Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量均降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠Nestin mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA相對(duì)含量比較

3 討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SCI后，通過阻斷或促進(jìn)來干預(yù)神經(jīng)再生的信號(hào)通路，可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)再生恢復(fù)[2]。在眾多的信號(hào)通路中，最常見的調(diào)控通路是PI3K/Akt信號(hào)通路，通過適當(dāng)調(diào)節(jié)上游相關(guān)因子(如生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子、壓力刺激因子等)位點(diǎn)，將信號(hào)整合分析后，最終激活下游一系列效應(yīng)因子的改變，從而調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞分化、存活、凋亡[3]。

PI3K下游的直接靶點(diǎn)蛋白是Akt，Akt在調(diào)控各種不同細(xì)胞功能(包括代謝、生長(zhǎng)、增殖、存活、轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)合成)方面發(fā)揮重要作用。PI3K被激活后，促使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上進(jìn)行磷酸化，使Akt完全被激活。Akt及胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)磷酸化水平的增加能夠啟動(dòng)PI3K/Akt信號(hào)通路下游聯(lián)合反應(yīng)，進(jìn)一步磷酸化下游的B淋巴細(xì)胞瘤-2基因相關(guān)啟動(dòng)子(Bad)、mTOR、半胱天冬酶3(caspase-3)等系列底物，從而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)控作用，對(duì)抗神經(jīng)元凋亡并促進(jìn)神經(jīng)元存活。因此，目前大部分通過Akt通路發(fā)揮促細(xì)胞存活、抗細(xì)胞凋亡的研究，主要是通過磷酸化Akt下游系列底物來實(shí)現(xiàn)的[4]。Akt下游明星分子mTOR則是調(diào)節(jié)生長(zhǎng)與代謝的這樣的一個(gè)樞紐分子，通過磷酸化下游mTOR可以起到調(diào)節(jié)自噬[5]、改善組織局部微環(huán)境的作用，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以通過特異性阻斷劑雷帕霉素來阻斷該作用[6]。胡凌云等[7]也證實(shí)，通過ATP激活A(yù)kt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路，SCI后Nestin及NeuN的陽性細(xì)胞表達(dá)明顯增加，并且此通路可以被雷帕霉素阻斷，從而降低陽性細(xì)胞的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)研究表明，PI3K/Akt/mTOR通路參與了SCI后神經(jīng)修復(fù)的過程，如大鼠SCI早期神經(jīng)功能的自我重建有關(guān)[8-9]。并且由此通路介導(dǎo)的某些miRNAs參與了SCI后的病理、生理過程,在SCI后可以出現(xiàn)異常的表達(dá)，可以通過調(diào)控miRNAs來促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)[10-13]，使內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞重新獲得向神經(jīng)元細(xì)胞增殖和分化能力，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。沈黎明[14]研究證實(shí)，調(diào)控miR-181d-5p位點(diǎn)可以抑制PTEN基因的表達(dá)，激活PI3K/Akt通路，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞軸突的伸長(zhǎng)。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)，體外細(xì)胞移植干預(yù)后也可以激活PI3K/Akt/mTOR通路，如腎下腹主動(dòng)脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)后，SCI病灶局部VEGF表達(dá)增加，進(jìn)而介導(dǎo)其下游信號(hào)通路PI3K/Akt的激活，促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)[15]；移植神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)轉(zhuǎn)染的雪旺細(xì)胞能夠有效促進(jìn)SCI大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，其機(jī)制可能也與激活mTOR信號(hào)通路有關(guān)[16]。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)很多中藥復(fù)方改善和保護(hù)神經(jīng)的作用都是基于PI3K/Akt信號(hào)通路，因?yàn)槠渲兴幓钚猿煞至己玫陌踩约澳退幮?，受到了越來越多的關(guān)注與研究。本研究所用補(bǔ)陽還五湯出自清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，主治氣虛血瘀證，具有補(bǔ)氣、活血、通絡(luò)的功效，本方既是益氣活血法的代表方，又是治療中風(fēng)后遺癥的常用方?，F(xiàn)代臨床常用于治療腦血管意外后遺癥及各種原因引起的偏癱、截癱、半身不遂、肢體痿軟等屬氣虛血瘀者[17]。臨床觀察證實(shí)補(bǔ)陽還五湯對(duì)SCI的恢復(fù)具有促進(jìn)作用[18]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，SCI所致的肢體萎軟無力，甚至偏癱、截癱等證屬督脈受損，瘀血阻絡(luò)，傷后多久臥活動(dòng)不便，久臥傷氣，故氣虛血瘀之證多見，患者常見苔白，脈緩，亦為氣虛佐證，且亦屬于“因虛致瘀”。脊髓解剖結(jié)構(gòu)同古人所描述的督脈十分相似，現(xiàn)代中醫(yī)認(rèn)為SCI會(huì)導(dǎo)致督脈受損。SCI的病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí), 本虛為肝腎、氣血虧虛, 標(biāo)實(shí)是指瘀血和痰濁阻滯經(jīng)絡(luò)。中醫(yī)治療SCI以補(bǔ)養(yǎng)氣血、活血祛瘀、通督為原則，兼顧強(qiáng)筋骨、填精補(bǔ)髓。補(bǔ)陽還五湯方中生黃芪為君藥，重用以大補(bǔ)脾胃之元?dú)?，使氣旺血行，瘀去絡(luò)通；臣以當(dāng)歸尾活血兼養(yǎng)血，有化瘀而不傷血之妙；佐以地龍通經(jīng)活絡(luò)，赤芍、川芎、桃仁、紅花助當(dāng)歸活血祛瘀，具有活血通絡(luò)、益氣之功效。研究表明，補(bǔ)陽還五湯方中的生物堿、苷、多糖、苷元是其主要有效部位[19-20]。顧志榮等[21]對(duì)具有神經(jīng)保護(hù)作用的中藥進(jìn)行總結(jié)分析，發(fā)現(xiàn)其主要分布在補(bǔ)益藥的苷類及多糖類成分，清熱藥的生物堿類，還有部分活血藥中。而補(bǔ)陽還五湯的配伍特點(diǎn)正是大量的補(bǔ)氣藥(黃芪)與適當(dāng)?shù)幕钛?當(dāng)歸、赤芍、桃仁、紅花)相配，使氣旺血行，活血不傷正。這也從側(cè)面印證了古代醫(yī)家應(yīng)用本方治療神經(jīng)損傷用藥的合理性，與現(xiàn)代生物學(xué)的研究結(jié)果不謀而合。研究證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯可以改善SCI大鼠的運(yùn)動(dòng)能力，其效果與糖皮質(zhì)激素甲基強(qiáng)的松龍相當(dāng)，可能與升高脊髓組織中再生基因蛋白2(Reg-2)和少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子2(Olig-2)蛋白及抑制mTOR蛋白表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分裂增殖活性，減輕炎性反應(yīng)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[22]。補(bǔ)陽還五湯還可以抑制過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，下調(diào)Caspase-3、Caspase-9及Caspase-12的表達(dá)[23]，增加Ⅰ型膠原蛋白和Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)，從而改善SCI后大鼠的肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙[24]。

Nestin最早在胚胎大鼠的脊髓神經(jīng)管神經(jīng)前體細(xì)胞(NPCs)上發(fā)現(xiàn)表達(dá)，在胚胎期, Nestin表達(dá)強(qiáng)度隨著神經(jīng)細(xì)胞的不斷成熟,逐漸減弱甚至消失, 當(dāng)機(jī)體成年后,室管膜細(xì)胞即處于“靜止”狀態(tài),當(dāng)受到損傷后,又會(huì)應(yīng)激而重新進(jìn)入分化的活躍狀態(tài)。Nestin陽性細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)前體細(xì)胞,Nestin為NSCs的自我更新所需[25]，實(shí)驗(yàn)中常用來表示神經(jīng)細(xì)胞功能的改善指標(biāo)。

本研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯干預(yù)SCI大鼠后，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路被激活，神經(jīng)細(xì)胞Nestin表達(dá)及Akt、mTOR蛋白明顯增多，CBS評(píng)分明顯優(yōu)于模型組(P<0.05)；將PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路阻斷后，功能改善情況不及未阻斷的補(bǔ)陽還五湯組，且與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明補(bǔ)陽還五湯是通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)SCI神經(jīng)功能的改善。補(bǔ)陽還五湯激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的機(jī)制可能是促使發(fā)生PI3K磷酸化，進(jìn)而促使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上，在3-磷脂酰肌醇依賴性激酶1(PDK1)和PDK2的協(xié)同作用下促進(jìn)Akt磷酸化，從而使Akt完全被激活[26]。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯能夠通過激活PI3K/Akt/mTOR通路，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞Nestin表達(dá)，參與SCI神經(jīng)功能的修復(fù)，并且可以被阻斷劑阻斷降低療效，為以后臨床中應(yīng)用補(bǔ)陽還五湯治療SCI提供了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ)。