糖濃度對(duì)野生篤斯越橘組織培養(yǎng)苗的影響

王鑫，吳國峰，盧慧穎，張文達(dá)，張妍妍*

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所，哈爾濱 150081；2.黑龍江大學(xué)，哈爾濱 150006)

篤斯越橘(VacciniumuliginosumLinn.)又名野生藍(lán)莓、篤斯等，杜鵑花科越橘屬的多年生灌木或小灌木植物，耐寒、耐旱，耐瘠薄，耐病蟲害，主要用于林果，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。組織培養(yǎng)是開展野生篤斯越橘遺傳育種研究的重要技術(shù)手段，但由于馴化程度較低，開展研究較晚，對(duì)培養(yǎng)基的組分及配比尚未清楚，因此在組織培養(yǎng)過程中常出現(xiàn)組培苗細(xì)弱，生長(zhǎng)不佳，分化差等問題。研究以大興安嶺篤斯越橘初選優(yōu)樹子代為材料，通過設(shè)置蔗糖梯度實(shí)驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)基中蔗糖濃度、葉片可溶性糖含量及器官分化水平三者間的互作關(guān)系展開探討，初步確定了該選育群體最適宜的培養(yǎng)基蔗糖濃度。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2019年秋季于大興安嶺采摘優(yōu)良單株種子，冷凍儲(chǔ)藏，2020年7月誘導(dǎo)萌發(fā)，后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基，單株編號(hào)，一次標(biāo)記為SS(實(shí)生)-1、2、3……n，繼代培養(yǎng)擴(kuò)繁。本試驗(yàn)隨即選取編號(hào)SS-6、SS-35和SS-50第四代組培苗為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗繼代增殖的影響。以改良MS為基本培養(yǎng)基，附加玉米素(ZT)0.5 mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.5 mg/L，蔗糖濃度為20、30、40、50、60、70、80 g/L，pH值為6.8。將繼代培養(yǎng)試管苗剪成1.5 cm左右，每莖段5片葉片，每瓶培養(yǎng)基接種6株，每個(gè)編號(hào)每個(gè)濃度各接種10瓶，分別標(biāo)記，于(25±2)℃，24 h光照培養(yǎng)室培養(yǎng)。接種20天開始觀察組培苗分化情況，60天后統(tǒng)計(jì)組培面分化株數(shù)，利用游標(biāo)卡尺測(cè)量單株根莖直徑，每個(gè)編號(hào)五個(gè)重復(fù)，求平均值。

1.2.2 不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗葉片可溶性糖含量的影響。利用蒽酮比色法對(duì)60天組培苗葉片進(jìn)行可溶性糖測(cè)定，因?yàn)楹?0、70、80 g/L培養(yǎng)基中組培已經(jīng)死亡，因此不對(duì)他們進(jìn)行含糖量測(cè)定。利用可溶性糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)標(biāo)號(hào)采取0.2 g左右新鮮葉片，測(cè)定葉片中可溶性糖含量，求得葉片糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗繼代增殖的影響

2.1.1 試驗(yàn)結(jié)果。在試驗(yàn)進(jìn)行20天時(shí)，接種苗分化已可見差別，從圖1、2、3中可看出，含糖20、30、40、50 g/L的培養(yǎng)基中，接種苗分化較多，60 g/L培養(yǎng)基中苗分化非常少，但苗仍具活性，而70、80 g/L培養(yǎng)基中，苗已幾乎全部死亡。

圖1 SS-6在不同濃度糖含量下生長(zhǎng)增殖情況(20 d)

圖2 SS-35在不同濃度糖含量下生長(zhǎng)增殖情況(20 d)

圖3 SS-50在不同濃度糖含量下生長(zhǎng)增殖情況(20 d)

接種60天后，對(duì)組培苗進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，此時(shí)由圖4、5、6可看出，含糖20、30、40 g/L培養(yǎng)基中組培苗的分化增殖非常好，50 g/L分化較弱，苗木質(zhì)化明顯，而60、70、80 g/L培養(yǎng)基中組培苗基本死亡，具體生長(zhǎng)及數(shù)據(jù)情況可見表1。

圖4 SS-6在不同濃度糖含量下生長(zhǎng)增殖情況(60 d)

圖5 SS-35在不同濃度糖含量下生長(zhǎng)增殖情況(60 d)

圖6 SS-50在不同濃度糖含量下生長(zhǎng)增殖情況(60 d)

表1 不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗繼代增殖的影響

2.1.2 分析。通過上訴表格可以看出，組培苗在含糖量20～50 g/L時(shí)均分化較好，但20 g/L時(shí)苗相對(duì)較軟，不利于組培苗增殖，而50 g/L時(shí)雖然分化，但是增殖倍數(shù)較少，木質(zhì)化明顯，都不合適下一步試驗(yàn)。30、40 g/L比較適合組培苗增殖，其中30 g/L分化效果較好，但是苗粗壯度不如40 g/L。

2.2 不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗葉片可溶性糖含量的影響

2.2.1試驗(yàn)結(jié)果。利用可溶性糖系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在630 nm下吸光度制得可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)。

圖7 可溶性糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和葉片提取液測(cè)定樣本在630 nm下的吸光度，計(jì)算出葉片糖含量(見表2)，并求得不同糖濃度下葉片內(nèi)可溶性糖的平均值(見表3)。

表2 不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗葉片可溶性糖含量的影響

表3 不同糖濃度培養(yǎng)基中葉片平均糖含量

2.2.2 分析。在含糖量分別為20、30、40、50 g/L的培養(yǎng)基中，兩組編號(hào)組培苗的葉片中可溶性糖含量走勢(shì)基本相同，均為先升高后下降(見表2)?？扇苄蕴遣粌H是高等植物的主要光合產(chǎn)物，而且是碳水化合物代謝和暫時(shí)貯藏的主要形式，由此可見，在一定范圍內(nèi)，培養(yǎng)基內(nèi)糖含量增高可以增加植物對(duì)糖的吸收利用，提高自身的生長(zhǎng)光合和物質(zhì)積累，但如果濃度過高，反而會(huì)起到抑制作用，甚至導(dǎo)致苗株死亡。

3 結(jié)論

通過培養(yǎng)基不同濃度糖含量對(duì)篤斯越橘組培苗分化及葉片含糖量差異的研究發(fā)現(xiàn)，在一定程度范圍內(nèi)的糖濃度對(duì)野生篤斯越橘組培苗增值都有明顯的促進(jìn)作用，過高或過低的蔗糖濃度會(huì)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)不健壯，葉片發(fā)黃，但濃度太高對(duì)繼代分化都有抑制作用，甚至苗株死亡。有關(guān)糖類對(duì)組培苗的作用機(jī)理也有不少學(xué)者作出了解釋，如孫書偉推測(cè)，低濃度蔗糖培養(yǎng)基可能不足以提供香花槐生根所需要的能量，因此發(fā)根晚，根生長(zhǎng)緩慢。結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，在培養(yǎng)基加入30 g/L蔗糖對(duì)野生篤斯越橘組培苗產(chǎn)生的分化效果最好，而且苗株生長(zhǎng)情況良好，適合進(jìn)一步的生產(chǎn)研究。而如果組培苗細(xì)弱，苗株需強(qiáng)壯時(shí)，40 g/L蔗糖培養(yǎng)基則效果更佳。