陸地棉ACX 基因家族的鑒定與功能分析

田一波，潘奧，陳勁，周仲華，袁小玲，劉志

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128）

20 世紀(jì)初以來(lái)， 全球平均氣溫上升了約1.5 ℃，且將來(lái)溫度會(huì)持續(xù)升高[1]。 隨著全球氣候的變暖，高溫逆境已成為影響棉花產(chǎn)量的重要非生物脅迫因素之一， 因此鑒定高溫耐性相關(guān)基因，進(jìn)而培育耐高溫棉花品種尤為重要。

研究表明， 高溫影響棉花和小麥脂肪酸代謝， 導(dǎo)致花藥發(fā)育異常， 甚至造成雄性不育[2-3]。Chen 等[4]運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和小RNA 測(cè)序技術(shù)深入分析了棉花花藥發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)譜變化及其對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝在花藥發(fā)育及育性表現(xiàn)上有重要作用。 隨后，在耐高溫與敏感棉花材料不同發(fā)育時(shí)期的花藥顯著性差異表達(dá)的基因中鑒定到一個(gè)與高溫耐性相關(guān)的酰基（脂酰） 輔酶A 氧化酶 （acyl coenzyme A oxidase,ACX）基因[5]。 ACX 與3- 酮?；? 輔酶A 硫解酶（硫解酶）和多功能蛋白烯?；? 輔酶A 水合酶/3- 羥基?；o酶A 脫氫酶是高等植物過(guò)氧化物酶體中脂肪酸β 氧化（β-oxidation）的代謝酶[6]，而脂肪酸β 氧化是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中快速降解儲(chǔ)備脂質(zhì)以提供碳源和能量的主要代謝途徑[7]，其中ACX 是該途徑中催化第1 步反應(yīng)的限速酶[8]。植物中存在多種ACX 同工酶， 其大小及亞基組成不同，且具有底物（短鏈、中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸）特異性。 Hooks 等[9]首先在玉米中鑒定到2 個(gè)ACX，發(fā)現(xiàn)其活性受生長(zhǎng)發(fā)育和代謝調(diào)控，且具有組織特異性。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的5 個(gè)ACX 分別催化不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸的降解，其中AtACX1和AtACX5基因參與茉莉酸（jasmonic acid, JA） 合成， 在雄蕊和花粉中高表達(dá)，與花藥發(fā)育、花粉育性和逆境響應(yīng)相關(guān)[10-11]。擬南芥acx4突變體中組蛋白乙?；瘻p少，而DNA 甲基化程度提高， 暗示該基因可能參與基因組表觀修飾[12]。水稻OsACX1和OsACX3在除種子外的多種組織器官表達(dá)，而OsACX2在種子中優(yōu)勢(shì)表達(dá)， 其中OsACX1受損傷和JA 誘導(dǎo)表達(dá)，可能參與JA 的生物合成[13]。 番茄ACX1和茶樹(shù)CsACX1與CsACX3也與JA 生物合成相關(guān)，參與損傷和病害應(yīng)激反應(yīng)[14-15]。

盡管人們?cè)谟衩譡9]、水稻[13]和擬南芥[16]等植物中相繼開(kāi)展了關(guān)于ACX基因家族的全基因組鑒定和功能研究，但在棉花中未見(jiàn)該基因家族的相關(guān)報(bào)道。本研究基于陸地棉（Gossypium hirsutumL.）遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法鑒定ACX基因家族成員，對(duì)其理化性質(zhì)、染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因復(fù)制以及表達(dá)模式等進(jìn)行全面分析，并利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默 （virus-induced gene silencing, VIGS）技術(shù)初步驗(yàn)證高溫耐性相關(guān)的GhACX16基因的生物學(xué)功能， 為后續(xù)陸地棉中ACX基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 棉花ACX 基因家族成員鑒定

在Pfam[17]數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pfam.xfam.org/）中搜索編號(hào)PF01756，下載ACOX 結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型， 從棉花功能數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cottonfgd.org/）中下載異源四倍體陸地棉[18]、海島棉[18]（G.barbadenseL.）及二倍體亞洲棉[19]（G.arboreum）、雷蒙德氏棉[20]（G.raimondii）的全基因組數(shù)據(jù)，利用HMMER 3.0[21]中的Hmmsearch 功能比對(duì)得到ACX基因家族成員， 并在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的Conserved Domain（CDD）[22]數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）軟件中進(jìn)一步確定其保守結(jié)構(gòu)域，鑒定ACX基因家族成員。 在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR10[23]（https://www.Arabidopsis.org/）中下載擬南芥ACX基因家族成員蛋白序列[24]，與棉花TM-1 基因組進(jìn)行比對(duì)鑒定， 進(jìn)一步搜索棉花中ACX基因家族成員。

1.2 陸地棉ACX 蛋白的理化性質(zhì)、 亞細(xì)胞定位及保守基序預(yù)測(cè)分析

利用在線網(wǎng)站ExPASy[25]（https://web.expasy.org/compute_pi/） 獲得GhACX 蛋白的理論等電點(diǎn)和分子質(zhì)量等信息。 利用Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/） 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。 用MEME[26]（http://meme-suite.org/）在線網(wǎng)站分析其保守基序，參數(shù)設(shè)置：最大查找數(shù)量為10，其他為默認(rèn)參數(shù)；最后用TBtools[27]軟件對(duì)其進(jìn)行可視化處理。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建和基因結(jié)構(gòu)分析

利用ClustalX 1.83[28]軟件對(duì)陸地棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉、海島棉、擬南芥ACX基因家族成員的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，采用IQ-TREE[29]軟件搜索到最佳堿基替代模型LG＋G4， 然后利用最大似然法（maximum likehood, ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，自展值設(shè)置為1 000。最后使用GSDS 2.0在線工具（http://gsds.gao-lab.org/）將基因結(jié)構(gòu)可視化。

1.4 陸地棉ACX 基因的染色體定位和基因復(fù)制分析

從陸地棉基因組注釋文件中提取ACX基因染色體位置信息，用MapChart 2.32[30]軟件進(jìn)行基因的染色體定位分析。利用軟件MCScanX[31]檢測(cè)陸地棉全基因組復(fù)制基因?qū)?，參?shù)設(shè)置：蛋白比對(duì)E值小于1×e-10，至少75%序列相似度。 利用KaKs_Calculator 2.0[32]軟件計(jì)算陸地棉復(fù)制基因?qū)Φ姆峭x突變率（non-synonymous mutation rate,Ka）和同義突變率（synonymous mutation rate,Ks）以及二者的比值（Ka/Ks）。

1.5 陸地棉ACX 基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

利用perl 腳本提取陸地棉ACX家族基因編碼區(qū)（coding sequence, CDS）上游2 000 bp 序列作為啟動(dòng)子區(qū)域，將獲得的序列在啟動(dòng)子預(yù)測(cè)網(wǎng)站PlantCARE[33]（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中檢索，鑒定啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件， 整理得到的文件信息，用TBtools[27]軟件進(jìn)行可視化展示。

1.6 陸地棉ACX 家族基因表達(dá)模式分析

從NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫(kù)[34]（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/）中下載陸地棉TM-1 在非生物脅迫（37 ℃高溫，4 ℃低溫，0.4 mol·L-1NaCl 鹽脅迫，200 g·L-1的PEG 6000 溶液模擬干旱脅迫）下的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)， 序列號(hào)為PRJNA490626，高溫脅迫下陸地棉花藥轉(zhuǎn)錄組的序列號(hào)為SRP218740[4]。 利用fastap、hisat 和StringTie 等軟件包分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)并進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算，提取ACX基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，用log2（FPKM）將表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，利用R/pheatmap 將表達(dá)數(shù)據(jù)可視化。

1.7 陸地棉GhACX16 功能的初步驗(yàn)證

參照潘奧等[35]的方法，以陸地棉TM-1 為材料，通過(guò)VIGS 技術(shù)初步驗(yàn)證GhACX16的功能。菌種： 農(nóng)桿菌GV3101； 煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus, TRV）載體：病毒復(fù)制酶載體pYL192:RNA1；目的基因插入載體pYL156:RNA2-GhACX16 ， 陽(yáng) 性 對(duì) 照 載 體 pYL156 : RNA2-GrCLA1，陰性對(duì)照載體pYL156:RNA2。 試驗(yàn)所用引物信息參見(jiàn)附表1。

將棉苗置于光照14 h/ 黑暗10 h， 晝夜溫度為28 ℃/25 ℃條件下培養(yǎng)。 待子葉完全展開(kāi)時(shí)，分別將含pYL156:RNA2-GhACX16 重組載體的菌液和含有pYL192:RNA1 空載體的菌液按1∶1的比例混合均勻后對(duì)棉苗子葉進(jìn)行接種。 當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照棉苗葉片出現(xiàn)白化現(xiàn)象時(shí)，采集陰性對(duì)照和試驗(yàn)組的葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR），選取Actin 9（AY305737）作為內(nèi)參基因[36]。 采用2-ΔΔCt 法[37]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

在4 片真葉期， 將GhACX16基因沉默棉苗與陰性對(duì)照棉苗置于42 ℃培養(yǎng)箱中高溫處理3 d，期間保證正常水分供應(yīng)。 處理3 d 后基因沉默棉苗和陰性對(duì)照棉苗的表型出現(xiàn)明顯差異時(shí)，取倒2～3 片真葉，使用Solarbio（索萊寶）公司試劑盒分別測(cè)定葉片中脯氨酸含量、 丙二醛含量、葉綠素含量和過(guò)氧化氫酶活性。 所有材料均是隨機(jī)取樣，每次試驗(yàn)設(shè)置至少3 次重復(fù)。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS Statistics 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），并根據(jù)分析結(jié)果使用GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陸地棉ACX 基因家族的鑒定

從陸地棉基因組中共鑒定出20 個(gè)ACX基因，分別命名為GhACX1～GhACX20。ACX家族基因的CDS 長(zhǎng)度為1 302～2 070 bp， 編碼的蛋白質(zhì)含433～689 個(gè)氨基酸， 分子量為47.7～77.3 ku。 等電點(diǎn)為6.57～9.02，平均等電點(diǎn)為8.16，表明該家族蛋白偏堿性。 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，ACX 蛋白定位于過(guò)氧化物酶體中（附表2）。

陸地棉20 個(gè)ACX基因分布在13 條染色體上。A 亞組和D 亞組的ACX基因數(shù)量一樣多，均有10 個(gè)； 大多數(shù)ACX基因分布在染色體兩端；A01、A11、A12、D01、D09、D11，D12 染 色 體 均 存在2 個(gè)ACX基 因，A03、A09、A10、A13、D02、D10 染色體各存在1 個(gè)ACX基因（圖1）。

圖1 陸地棉ACX 家族基因染色體分布Fig. 1 Chromosome distribution of ACX genes in G. hirsutum

2.2 陸地棉ACX 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

為了解陸地棉ACX家族成員的進(jìn)化關(guān)系，分別從陸地棉、海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉和擬南芥中鑒定出20、20、11、11 和6 個(gè)ACX家族成員。 聚類(lèi)結(jié)果顯示，陸地棉、海島棉、亞洲棉、雷蒙德氏棉和擬南芥的ACX家族成員都可分為4 個(gè)亞 族， 分 別 為Clade_I、Clade_II、Clade_III 和Clade_IV 亞族。 陸地棉和海島棉的ACX家族基因在4 個(gè)亞族中的分布數(shù)量完全一致， 其中在Clade_I 和Clade_III 亞族中的數(shù)量最多， 各有6和8 個(gè)ACX成員，在Clade_II 亞族中均有4 個(gè)，而在Clade_IV 亞族中均只有2 個(gè)。 亞洲棉和雷蒙德氏棉中ACX家族基因在4 個(gè)亞族中的分布數(shù)量也完全相同，在Clade_I 和Clade_III 亞族中各有3 和4 個(gè)ACX成員，在Clade_II 和Clade_IV 亞族中均只有2 個(gè)ACX成員。擬南芥中ACX家族基因在Clade_I 和Clade_III 亞族中均有2個(gè)，而在Clade_II 和Clade_IV 亞族中均只有1 個(gè)（圖2）。

圖2 ACX 家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of ACX family members

2.3 陸地棉ACX 基因的染色體復(fù)制分析

為了解陸地棉ACX基因的進(jìn)化復(fù)制關(guān)系，對(duì)該家族成員進(jìn)行了復(fù)制基因比對(duì)。 除GhACX2、GhACX10、GhACX14、GhACX20沒(méi) 有 找 到 復(fù) 制的同源基因?qū)ν?，共檢測(cè)出20 個(gè)同源基因?qū)Γ▓D3）， 其中A 亞組有4 對(duì)同源基因 （藍(lán)色連線：GhACX3/GhACX8、GhACX4/GhACX6、GhACX4/GhACX9、GhACX6/GhACX9），D 亞 組 有3 對(duì)（紅色連線：GhACX11/GhACX13、GhACX13/GhACX19、GhACX15/GhACX17），A、D 亞組間有13 對(duì)（綠色連線：GhACX1/GhACX11、GhACX3/GhACX12、GhACX3/GhACX13、GhACX3/GhACX19、GhACX4/GhACX15、GhACX4/GhACX17、GhACX5/GhACX16、GhACX6/GhACX17、GhACX7/GhACX18、GhACX8/GhACX13、GhACX8/GhACX19、GhACX9/GhACX15、GhACX9/GhACX17）。這些同源基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于0.5 （附表3）， 說(shuō)明陸地棉ACX基因在進(jìn)化過(guò)程中經(jīng)歷了較為強(qiáng)烈的純化選擇，暗示ACX基因進(jìn)化保守，功能穩(wěn)定。

圖3 陸地棉ACX 家族成員染色體分布和共線性關(guān)系Fig. 3 Chromosome distribution and collinearity of ACX family members in G. hirsutum

2.4 陸地棉ACX 蛋白保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)預(yù)測(cè)分析， 陸地棉ACX 蛋白序列含有10個(gè)保守基序， 其中motif 1、motif 2、motif 7、motif 10 存在于所有ACX 家族成員中， 說(shuō)明這些基序?yàn)樵摷易宄蓡T的保守基序（圖4A）。 Clade_I 亞族所有基因均含有14 個(gè)外顯子；Clade_II 亞族中所有基因均含有7 個(gè)外顯子；Clade_III 亞族中只有GhACX3有12 個(gè)外顯子，其余基因都含有13 個(gè)外顯子；Clade_IV 亞族基因均含有13 個(gè)外顯子（圖4B）。 陸地棉ACX基因家族有高度相似的蛋白基序和外顯子數(shù)量， 說(shuō)明陸地棉中ACX基因較為保守，可能具有相似的功能。

圖4 陸地棉ACX 蛋白保守基序（A）和基因結(jié)構(gòu)（B）Fig. 4 Conserved motifs (A) and gene structure (B) of ACX in G. hirsutum

2.5 陸地棉ACX 基因順式作用元件分析

經(jīng)預(yù)測(cè)， 陸地棉ACX基因啟動(dòng)子區(qū)含有熱 應(yīng)激（CCAAT-box、AT-rich element）、植物激素 （TGACG-motif、CGTCA-motif、TGA-element、GARE-motif、ABRE）、干旱（MBS、MYC）、光應(yīng)答（P-box、G-box、AE-box、TCT-motif、GATA-motif）和 防 衛(wèi) 與 脅 迫 響 應(yīng) （TC-rich repeats、W-box、MRE）等相關(guān)順式作用元件（附圖1）。 其中熱應(yīng)激 元 件 （AT-rich element） 存 在 于GhACX14、GhACX7、GhACX5、GhACX16和GhACX19的啟動(dòng)子區(qū)， 即該熱響應(yīng)元件主要集中在Clade_II亞族中，說(shuō)明Clade_II 亞族可能在熱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。 干旱響應(yīng)元件（MBS、MYC）和防御與脅迫響應(yīng)調(diào)控元件（TC-rich repeats）存在于大部分陸地棉ACX基因的啟動(dòng)子區(qū)，且數(shù)量最多，暗示陸地棉ACX基因家族在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

2.6 陸地棉ACX 基因家族在不同脅迫處理下的表達(dá)模式分析

陸地棉ACX基因在不同脅迫處理下的表達(dá)分析結(jié)果 （圖5） 顯示：37 ℃高溫處理1 h后，GhACX6、GhACX17、GhACX7、GhACX18、GhACX5、GhACX16、GhACX1和GhACX11的表達(dá)量明顯升高；而在處理3 h 后，這6 個(gè)基因表達(dá)量降低，隨后又升高。 4 ℃冷脅迫處理1 h后，GhACX10、GhACX6、GhACX17、GhACX5、GhACX16和GhACX11的表達(dá)量明顯降低，處理3 h 后，這些基因的表達(dá)量又升高。 鹽脅迫處理后1 h，GhACX10、GhACX7、GhACX18、GhACX5、GhACX16、GhACX19、GhACX1和GhACX11明顯上調(diào)表達(dá)。 PEG 6000 模擬干旱脅迫處理后3 h，GhACX6、GhACX17、GhACX7、GhACX18、GhACX5和GhACX16下調(diào)表達(dá)， 處理后6 h 又上調(diào)表達(dá)（圖5）。 陸地棉ACX基因在不同非生物脅迫下的表達(dá)量均發(fā)生不同程度的變化，表明它們可能在高溫、低溫、鹽脅迫和干旱脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。從以上分析結(jié)果來(lái)看，GhACX5和GhACX16基因的表達(dá)量在高溫、低溫、鹽和干旱脅迫中均發(fā)生明顯變化， 二者可能是重要的逆境響應(yīng)基因。

圖5 陸地棉ACX 基因在不同脅迫處理下的表達(dá)模式Fig. 5 Expression pattern of ACX gene in G. hirsutum under different stress treatments

2.7 高溫脅迫下棉花花藥中ACX 基因的表達(dá)模式分析

利用實(shí)驗(yàn)室前期獲得的高溫脅迫下耐高溫與高溫敏感型棉花材料不同發(fā)育時(shí)期的花藥轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)， 分析ACX基因家族成員的表達(dá)譜（圖6）。 在高溫與正常條件下， 除了GhACX4、GhACX15、GhACX3、GhACX13、GhACX2和GhACX12基因處于穩(wěn)定的低表達(dá)水平外， 其他基因的表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期的花藥中均發(fā)生不同程度的變化。 但在高溫脅迫與正常條件下，GhACX10、GhACX14、GhACX6、GhACX17、GhACX9 、GhACX20、GhACX7、GhACX18、GhACX8、GhACX19、GhACX1和GhACX11基因在2 種耐熱性不同的棉花材料中的表達(dá)趨勢(shì)相似， 或者無(wú)明顯差異。GhACX5和GhACX16基因的表達(dá)量在高溫脅迫與正常條件下的耐高溫和敏感棉花不同發(fā)育時(shí)期的花藥中均存在明顯差異，推測(cè)這2 個(gè)基因可能參與高溫脅迫響應(yīng)。

圖6 高溫處理和正常條件下耐高溫與高溫敏感棉花不同發(fā)育時(shí)期的花藥中ACX 基因的表達(dá)模式Fig. 6 Expression patterns of ACX genes in the anthers at different developmental stages of the high temperature tolerant and sensitive cotton lines under high temperature and normal control conditions

2.8 利用VIGS 技術(shù)初步驗(yàn)證GhACX16 基因的功能

結(jié)合以上ACX基因的表達(dá)模式和前期轉(zhuǎn)錄組分析[2]，采用VIGS 技術(shù)對(duì)GhACX16基因的功能進(jìn)行初步驗(yàn)證。 當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組棉苗出現(xiàn)白化癥狀時(shí) （圖7A）， 利用qRT-PCR 鑒定試驗(yàn)組棉苗GhACX16基因的沉默效果 （圖7B）， 然后將TRV:GhACX16 棉苗和TRV:00 棉苗置于42 ℃培養(yǎng)箱連續(xù)處理3 d。TRV:GhACX16 棉花材料表現(xiàn)出較好的高溫耐受性，而陰性對(duì)照棉花材料葉片表現(xiàn)為較嚴(yán)重的枯黃萎焉（圖7C）。 生理生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示， 與陰性對(duì)照組相比，TRV:GhACX16 棉花葉片的丙二醛含量顯著降低，而脯氨酸含量、葉綠素含量和過(guò)氧化氫酶活性顯著升高（圖7D～G）。 以上結(jié)果表明沉默GhACX16基因增強(qiáng)了棉苗的高溫耐受性， 說(shuō)明GhACX16是一個(gè)重要的高溫響應(yīng)基因。

圖7 高溫脅迫下GhACX16 基因沉默棉花幼苗表型及生理生化指標(biāo)測(cè)定Fig. 7 Phenotype and physiological and biochemical indexes of GhACX16 gene-silenced cotton seedlings under high temperature stress

3 討論

近年來(lái)，隨著棉花基因組測(cè)序工作的陸續(xù)完成，基因家族鑒定為研究基因功能提供了重要線索， 但關(guān)于陸地棉ACX基因家族的研究還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究利用生物信息學(xué)分析方法，在陸地棉和海島棉中均鑒定到20 個(gè)ACX基因，在亞洲棉和雷蒙德氏棉基因組中均鑒定到11 個(gè)，ACX基因數(shù)量差異可能是棉花基因組加倍的結(jié)果[38-39]。20 個(gè)陸地棉ACX基因分布在13 條染色體上，A亞組和D 亞組各10 個(gè)。 聚類(lèi)分析將陸地棉ACX基因分為4 個(gè)亞族，其他棉種（海島棉、亞洲棉和雷蒙德氏棉） 的ACX基因在這4 個(gè)亞族中均有分布，說(shuō)明其在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。 基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，20 個(gè)陸地棉ACX蛋白均含有4 個(gè)相同的基序，且同一亞族的基因有高度相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)，說(shuō)明其進(jìn)化高度保守， 可能具有相似的功能。 只有GhACX10和GhACX14基因 （擬南芥AtACX4的同源基因）沒(méi)有ACOX 結(jié)構(gòu)域，可能是進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生功能分化所致。 共線性分析預(yù)測(cè)到20對(duì)同源基因，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)基因，說(shuō)明片段復(fù)制是ACX基因的主要擴(kuò)張動(dòng)力。 基因復(fù)制和基因組加倍為生物進(jìn)化提供原料和動(dòng)力[40]。如果Ka/Ks比值大于1 表示有正選擇效應(yīng)； 如果Ka/Ks值小于1 則認(rèn)為存在純化選擇作用； 如果Ka/Ks值等于1 說(shuō)明有中性選擇[41]。 陸地棉ACX同源基因的Ka/Ks值均小于0.5， 說(shuō)明ACX基因家族高度保守，經(jīng)歷了較強(qiáng)烈的純化選擇作用。

ACX基因編碼的?；o酶A 氧化酶是脂肪酸β 氧化中的限速酶，同時(shí)參與生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)和JA 合成。 脂肪酸代謝不僅與油料種子萌發(fā)和生長(zhǎng)發(fā)育中的能量代謝有關(guān)，還參與逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程，已有研究表明與脂肪酸降解相關(guān)的基因在植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)中具有重要作用[42]。 陸地棉ACX基因的啟動(dòng)子區(qū)存在高溫、低溫、干旱和激素響應(yīng)等相關(guān)順式作用元件，可能有助于適應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育中遭遇的各種逆境脅迫。 在高溫、低溫、鹽和模擬干旱脅迫處理下，陸地棉ACX家族基因的表達(dá)量發(fā)生明顯變化，表明該家族基因可能在非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。 高溫脅迫下棉花花藥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，在花藥發(fā)育后期部分ACX基因的表達(dá)水平明顯降低， 耐高溫棉花花藥中部分ACX基因的表達(dá)量低于高溫敏感棉花材料， 其中GhACX16基因的表達(dá)量變化最為明顯。 高溫脅迫下GhACX16基因沉默的棉花幼苗表現(xiàn)出明顯的耐高溫表型，其葉片丙二醛含量顯著低于陰性對(duì)照，脯氨酸含量、過(guò)氧化氫酶活性和葉綠素含量顯著高于陰性對(duì)照，由此推測(cè)抑制GhACX16的表達(dá)能夠提高棉花對(duì)高溫脅迫耐受性，本研究為棉花耐高溫遺傳改良提供了重要的基因資源。

4 結(jié)論

在陸地棉中鑒定到20 個(gè)ACX基因家族成員，聚類(lèi)分析將其分為4 個(gè)亞族。 基因片段復(fù)制是ACX基因的主要擴(kuò)張動(dòng)力。ACX家族基因在高溫、低溫、鹽和模擬干旱脅迫下表達(dá)量均發(fā)生明顯變化，可能是非生物脅迫響應(yīng)的重要調(diào)節(jié)基因。GhACX16基因沉默的棉花幼苗在高溫脅迫下表現(xiàn)出明顯的耐高溫表型，說(shuō)明其在高溫脅迫響應(yīng)中可能發(fā)揮著重要的功能。

附件：

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附表1 本研究所用引物

Table S1 Primers for this study

附表2 陸地棉ACX基因家族成員基本信息

Table S2 Basic information ofACXgene family members inG.hirsutum

附表3 陸地棉ACX基因家族同源基因?qū)a/Ks分析

Table S3Ka/Ksanalysis of homologous gene pairs inACXgene family inG.hirsutum

附圖1 陸地棉ACX基因家族順式作用元件

Fig. S1Cis-acting elements ofACXgene family inG.hirsutum