陸地棉衰老相關(guān)基因GhSAG101 的克隆及抗病功能分析

吳健鋒，樊志浩，武連杰，胡曉旺，韓知里，高巍，龍璐

（ 河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004）

棉花（Gossypiumspp.）是世界上最重要的天然纖維作物，也是主要的油料作物[1]。中國70%以上的棉花種植區(qū)受到黃萎病的威脅， 黃萎病導(dǎo)致棉花產(chǎn)量大幅度下降，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。黃萎病菌大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）可以在土壤中以微菌核形式休眠長達(dá)15 年， 在適宜環(huán)境下被激活，萌發(fā)菌絲向寄主根系生長。 黃萎病菌侵入寄主植物后，在病株的根、莖和葉維管束內(nèi)大量繁殖， 激發(fā)鄰近細(xì)胞產(chǎn)生膠狀物堵塞導(dǎo)管，影響植物的蒸騰作用和營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸，同時(shí)分泌毒素蛋白，導(dǎo)致病株葉片枯萎、變黃，最終引起植物死亡[4]。

自然界存在的黃萎病菌復(fù)雜多樣，菌系之間存在落葉型和非落葉型、不同致病力的差異[5]。同一個(gè)菌系在不同的溫度下也會導(dǎo)致菌絲生長速度、產(chǎn)孢和毒素產(chǎn)生變化，從而影響致病力[6]。 番茄（Lycopersicum esculentum）中克隆的Ve1基因編碼1 個(gè)類受體蛋白激酶，是目前報(bào)道的唯一一個(gè)植物抗黃萎病主效基因。 Ve1 蛋白可特異性識別大麗輪枝菌和黑白輪枝菌（V.albo-atrum）的無毒蛋白Ave1，激活番茄的抗病性[7]。 然而由于國內(nèi)的黃萎病菌普遍缺乏Ave1 蛋白， 超表達(dá)Ve1的棉花轉(zhuǎn)基因材料因缺乏Ave1 識別過程， 不能激活Ve1 介導(dǎo)的下游抗性，因此Ve1在棉花育種中的應(yīng)用受到限制[8]。EDS1（enhanced disease susceptibility 1 gene）、NDR1（non-race-specific disease resistance 1 gene）、促分裂原活化的蛋白激酶激酶基因MKK2和BAK1等基因位于Ve1調(diào)控通路的下游，參與Ve1介導(dǎo)的番茄抗黃萎病反應(yīng)[9]，棉花中也存在相似的抗病反應(yīng)。 沉默GhNDR1、GhMKK2、GhBAK1和GbEDS1均 可 降 低棉花對黃萎病的抗性[10-12]。 此外，土壤中存在的其他病原生物，如線蟲等會加劇大田中黃萎病的發(fā)病率和發(fā)病程度。 這些因素使棉花生產(chǎn)中的黃萎病防控變得尤為困難。 因此，解析棉花抗黃萎病的分子機(jī)理，發(fā)掘關(guān)鍵抗病基因，利用生物技術(shù)培育抗病新品種，是當(dāng)前棉花抗病育種的重點(diǎn)[13]。

棉花與黃萎病菌的互作涉及多種生物學(xué)過程。 研究表明，細(xì)胞壁加固、次生代謝激活、抗病基因表達(dá)、激素介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程都與棉花對黃萎病菌的響應(yīng)相關(guān)[14-17]。Gao 等[14]通過蛋白組學(xué)分析結(jié)合病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）研究，證明了棉酚、茉莉酸和油菜素內(nèi)酯參與了棉花對黃萎病菌的抗性。 Mo 等[15]克隆了1 個(gè)多胺氧化酶（polyamine oxidase, PAO）基因GhPAO，其產(chǎn)物GhPAO 通過增加雙氧水（H2O2）、水楊酸和植保素的含量來增強(qiáng)植物對黃萎病的抗性。Xu 等[16]利用差異轉(zhuǎn)錄組和生化分析，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素在棉花抗黃萎病中有重要作用。隨后的研究證明GbERF1-like、GhMYB43、GhWAT1/2/3等基因編碼的蛋白質(zhì)通過調(diào)控下游信號通路，激活木質(zhì)素的生物合成來影響棉花抗病性[18-20]。

植物激素乙烯（ethylene，ET）在棉花抗病中的作用比較復(fù)雜。 黃萎病菌可誘導(dǎo)棉花體內(nèi)ET含量和ET 合成相關(guān)基因表達(dá)量的上升， 研究人員推測黃萎病菌可能通過ET 促進(jìn)葉片衰老、脫落，來提高致病力[21-22]。 接種黃萎病菌后，擬南芥（Arabidopsis thaliana） 乙烯不敏感基因（ethylene insensitive gene,EIN） 突變體etr1-1、ein3-1葉片黃化、衰老程度顯著低于野生型[23-24]。 然而敲除EIN2、EIN4和EIN6的擬南芥抗病性顯著降低[25]。上述文獻(xiàn)說明ET 在植物抗黃萎病的過程中存在雙重調(diào)控作用。Robison 等[26]通過用ET 抑制劑和ET 前體處理接種黃萎病菌的番茄， 證明了雙重調(diào)節(jié)作用的存在，并提出理論認(rèn)為：黃萎病侵染后ET 處理能增強(qiáng)番茄的感病性， 而在黃萎病侵染時(shí)ET 處理能抑制病害的發(fā)展。 這些研究結(jié)果揭示棉花與黃萎病菌之間的相互作用機(jī)理非常復(fù)雜，需要更深入和系統(tǒng)的研究，從而為棉花抗病的分子機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

衰老相關(guān)基因 （senescence-associated gene,SAG）廣泛存在于各種植物中，可編碼轉(zhuǎn)錄因子、激酶、轉(zhuǎn)運(yùn)子等各種類型的蛋白。SAG基因的表達(dá)變化，是植物進(jìn)入衰老過程的標(biāo)志。 如在擬南芥中，SAG101在葉片衰老初期表達(dá)， 反義RNA干擾SAG101表達(dá)的轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型相比，葉片衰老起始時(shí)間延遲4 d，說明SAG101的超表達(dá)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因擬南芥的早衰[27]。在擬南芥、水稻（Oryza sativa）等作物中，一些SAG基因被發(fā)現(xiàn)參與植物對病毒、細(xì)菌和真菌等病原菌的抗性[28]，但在棉花中未見相關(guān)報(bào)道。在擬南芥葉片衰老相關(guān)突變體中篩選鑒定的SAG101編碼EDS1類的?；饷傅鞍譡28]。 本研究在陸地棉（G.hirsutum）中鑒定到1 個(gè)受黃萎病菌誘導(dǎo)的SAG101基因， 通過整株、 離體葉片接種黃萎病菌，研究該基因在棉花抗黃萎病中的作用，可為棉花抗病育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 研究材料

陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1 由棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。 棉花VIGS 載體pTRV1、pTRV2 由荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Bart P. H. J. Thomma教授惠贈[9]。 棉花強(qiáng)致病力落葉型黃萎病菌菌系V991 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所簡桂良研究員提供，帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP） 標(biāo)簽的黃萎病菌強(qiáng)致病力菌株Vd592-GFP[29]由中國科學(xué)院郭慧珊研究員惠贈。

1.2 棉花培養(yǎng)

挑選飽滿的TM-1 種子在28 ℃、高濕度環(huán)境中催芽至胚根萌發(fā)長度為1.0～1.5 cm；選擇萌發(fā)良好且一致的種子播種到營養(yǎng)土中，在25 ℃、相對濕度70%、16 h 光照/8 h 黑暗的條件下培養(yǎng)。取兩葉一心期幼苗的根、莖、葉用于GhSAG101表達(dá)量檢測。

1.3 棉花總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄

稱取0.1 g 棉花各組織鮮樣，使用RNA 多糖多酚提取試劑盒DP441 （天根生化科技有限公司， 北京） 進(jìn)行棉花總RNA 提取。 取1 μg 總RNA，用M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶M1701（普洛麥格生物技術(shù)有限公司，北京）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用雙蒸水（ddH2O）稀釋50 倍，保存于-20 ℃，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）擴(kuò)增?？俁NA 提取和反轉(zhuǎn)錄的具體操作方法參考試劑盒說明書。

1.4 GhSAG101 的克隆和多重序列比對

用本實(shí)驗(yàn)室前期表達(dá)譜分析中所獲得的序列片段，在陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫（https://cottonfgd.org/）中進(jìn)行相似性BLAST 搜索，找到與目標(biāo)序列片段匹配度最高的基因，并設(shè)計(jì)基因全長引物SAG101-OF/OR（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增的具體操作方法參考TaqDNA 聚合酶P101 （諾唯贊生物科技有限公司，南京）試劑說明書。 在美國國家生物技術(shù)信息中心 （National Center for Biotechnology Information, NCBI）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中搜索下載與陸地棉Gh-SAG101 氨基酸序列一致性最高的擬南芥蛋白序列AtSAG101， 使用DNAMAN 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)多重序列比對。 用NCBI 數(shù)據(jù)庫中蛋白BLAST工具預(yù)測GhSAG101 蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

表1 本研究中用到的引物Table 1 Primers used in this research

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用SYBRGreen 染料法， 在ABI7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的擴(kuò)增， 反應(yīng)使用的試劑為ChamQ SYBR Qpcr 混合液Q711-02（諾唯贊生物技術(shù)有限公司，南京)。擴(kuò)增的目標(biāo)基因?yàn)镚hSAG101A/D， 內(nèi)參基因?yàn)镚hUB7（GhA12G1102），擴(kuò)增引物見表1。 每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置4 個(gè)技術(shù)重復(fù)，目標(biāo)基因的相對表達(dá)量用2-△△Ct 法計(jì)算。qRT-PCR 的體系和程序設(shè)置參考試劑盒說明書和Long 等[30]的方法。

1.6 VIGS 載體構(gòu)建

根據(jù)GhSAG101A/D的編碼序列設(shè)計(jì)引物GhSAG101-VF/VR（表1），以TM-1 的cDNA為模板擴(kuò)增SAG101基因開放閱讀框第27～421 bp 的VIGS 目標(biāo)片段， 片段長度為395 bp。并在正向引物GhSAG101-VF 的5' 端加入交換臂序列（AGAAGGCCTCCATGG）和BamHI 酶切位點(diǎn)（GGATCC）；在反向引物GhSAG101-VR 的5' 端加入交換臂序列（GAGACGCGTGAGCTC）和KpnI 的酶切位點(diǎn)（GGTACC）。 用一步克隆的方法構(gòu)建VIGS 載體： 擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物純化回收； 同時(shí)用XbaⅠ和KpnⅠ雙酶切VIGS 病毒載體pTRV2 質(zhì)粒， 酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳膠回收目的片段。 使用重組酶ExnaseⅡ（諾唯贊生物科技有限公司，南京）進(jìn)行目的片段與PCR 產(chǎn)物的一步克隆連接， 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，通過菌液PCR 篩選陽性克隆， 送北京六合華大基因科技有限公司測序，選擇含有正確目標(biāo)片段的克隆提取質(zhì)粒，獲得重組載體pTRV2∷SAG101。通過電轉(zhuǎn)化法將提取的質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101 中， 挑取單克隆菌落擴(kuò)繁進(jìn)行PCR 檢測，陽性克隆保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 VIGS 轉(zhuǎn)化

在10 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中分別加入100 μL 保 存 的pTRV1、pTRV2 和pTRV2 ∷SAG101農(nóng)桿菌， 在28 ℃、220 r·min-1搖床中過夜培養(yǎng)至OD600為1.2～1.5。 離心收集菌體細(xì)胞，用重懸液 （含10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-12-（N-嗎啉代）乙磺酸溶液，200 μmol·L-1乙酰丁香酮） 調(diào)節(jié)菌液濃度至OD600為0.6～0.8。 將pTRV1 重懸液分別與pTRV2 重懸液、pTRV2-SAG101 重懸液以1∶1 體積比混勻，在室溫自然光條件下靜置2 h 后注射生長7 d 的TM-1 幼苗子葉。 空載體pTRV2 轉(zhuǎn)化的對照材料記為TRV:00，pTRV2-SAG101 轉(zhuǎn)化的GhSAG101沉默材料記為TRV:SAG101。 注射后的幼苗避光培養(yǎng)12 h 后恢復(fù)光照培養(yǎng)（溫度25 ℃，相對濕度70%，16 h 光照/8 h 黑暗）。 注射10 d 后取幼嫩真葉提RNA， 通過qRT-PCR 檢測目標(biāo)基因沉默效率[14]。

1.8 黃萎病菌接種試驗(yàn)

取保存于-80 ℃的黃萎病菌V991 或Vd592-GFP 孢子液300 μL，均勻涂布在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)4～5 d。 用無菌水刮洗培養(yǎng)基上的黃萎病菌孢子，并用雙層紗布過濾。 用血球計(jì)數(shù)器計(jì)算孢子含量，接種前用純水將孢子含量調(diào)整為106mL-1[31]。 生長至兩葉一心時(shí)，將野生型幼苗從營養(yǎng)土中取出，用傷根接種法接種V991 孢子液， 以無菌水處理作為對照組，每組包含至少20 株棉花幼苗，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。 將長勢一致的棉花幼苗浸泡于黃萎病菌孢子液中約30 s， 用吸水紙吸去多余孢子液。將棉花幼苗重新移植到營養(yǎng)土中。 接種后的棉花放置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) （16 h 光照/8 h黑暗）。在接種后1 d、3 d、5 d、7 d 和9 d 時(shí)取對照組和試驗(yàn)組的根系，提取RNA，利用qRT-PCR 驗(yàn)證GhSAG101的誘導(dǎo)表達(dá)模式。

將VIGS 注射3 周后的TRV:00 和TRV:SAG101 棉花幼苗用傷根接種法接種黃萎病菌孢子液，接種后每天觀察植株發(fā)病情況，并統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。 發(fā)病率和病情指數(shù)計(jì)算方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 22101.5-2009）[32]。 接種黃萎病菌后15 d，取接種棉花材料子葉節(jié)下側(cè)1 cm 莖段，30°角斜剖莖段，在體式顯微鏡下觀察莖段維管組織褐化情況并拍照[33]。黃萎病菌離體葉片的接種方法：選取VIGS 處理后長勢一致的植株第2 片真葉進(jìn)行葉片接菌。 將葉片平鋪在濕潤濾紙上，在葉片中央葉脈處制造直徑為0.5 mm 的傷口， 在傷口處滴入15 μL 的Vd592-GFP 孢子液， 覆膜保濕并在25 ℃下避光培養(yǎng)[34]。每組包含至少10 片棉花真葉，設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。 每天觀察并記錄病斑大小，使用ImageJ 軟件統(tǒng)計(jì)病斑面積。 病斑處黃萎病菌菌絲的綠色熒光觀察使用MVX10 熒光體式顯微鏡（奧林巴斯，日本）。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhSAG101 的序列分析

在本實(shí)驗(yàn)室前期研究棉花響應(yīng)黃萎病菌的RNA-seq 數(shù)據(jù)庫中，篩選到1 條黃萎病菌侵染后表達(dá)量升高的核苷酸序列。 在陸地棉基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 搜索，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)基因是位于7 號染色體上的Ghir_A07G023460和Ghir_D07G023540，注釋為SAG101，因此將Ghir_A07G023460和Ghir_D07G023540分別命名為GhSAG101A和GhSAG101D。GhSAG101A和GhSAG101D的編碼區(qū)長度均為1 764 bp， 沒有內(nèi)含子， 編碼包含587 個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。 多重序列分析結(jié)果顯示，GhSAG101A 和GhSAG101D 的氨基酸序列一致性為95.7%，與擬南芥中的同源蛋白AtSAG101 氨基酸序列一致性為74.4%， 說明GhSAG101A/D 和AtSAG101可能存在相似的功能。 GhSAG101A/D 蛋白質(zhì)N端具有水解酶保守結(jié)構(gòu)域 （第110～212 個(gè)氨基酸殘基），其中包含1 個(gè)親核基序GHSLG（第141～145 個(gè)氨基酸殘基）。 水解酶保守結(jié)構(gòu)域廣泛存在于蛋白酶、脂酶、過氧化物酶等具有重要功能的蛋白中，核心的催化位點(diǎn)通常包括1 個(gè)絲氨酸、1 個(gè)谷氨酸或天冬氨酸和1 個(gè)組氨酸。GhSAG101A/D 蛋白質(zhì)C 端具有保守EP 結(jié)構(gòu)域（第358～463 個(gè)氨基酸殘基）， 這種高度保守的結(jié)構(gòu)域存在于EDS1 及其家族成員中，通過疏水相互作用、鹽橋和大量的氫鍵形成（圖1）。

圖1 GbSAG101A/D 和同源蛋白AtSAG101 的多重序列比對Fig. 1 Multiple sequence alignments of GbSAG101A/D with orthologous protein AtSAG101

2.2 GhSAG101 的表達(dá)模式分析

在兩葉一心時(shí)提取棉花幼苗根、 莖、 葉的RNA，研究GhSAG101基因的組織表達(dá)模式。 由于GhSAG101A和GhSAG101D基因高度同源，qRT-PCR 技術(shù)難以區(qū)分2 個(gè)基因， 因此本研究中擴(kuò)增的GhSAG101包括GhSAG101A和GhSAG101D基因的轉(zhuǎn)錄本。 如圖2A 所示，GhSAG101在棉花幼苗中的表達(dá)模式具有組織特異性。GhSAG101在根系中表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量略低， 約為根中表達(dá)量的40%左右。GhSAG101在葉片中表達(dá)量最低，為根中表達(dá)量的0.1%。

對黃萎病菌侵染后不同時(shí)間的GhSAG101表達(dá)分析結(jié)果（圖2B）表明：在水處理的對照組中，GhSAG101轉(zhuǎn)錄水平未出現(xiàn)較大的變化；在黃萎病菌接種的試驗(yàn)組中，GhSAG101在接種后5 d 和7 d 明顯上調(diào)表達(dá)，在接種后5 d 左右達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，在接種后9 d 恢復(fù)到本底表達(dá)水平。說明GhSAG101響應(yīng)了黃萎病菌侵染棉花的過程，在侵染的中后期（5～7 d）被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。

圖2 GhSAG101 的表達(dá)模式分析Fig. 2 Expression analysis of GhSAG101

2.3 GhSAG101 負(fù)調(diào)控棉花對黃萎病的抗性

VIGS 試驗(yàn)結(jié)果顯示：GhSAG101沉默的棉花植株TRV:SAG101 在形態(tài)上與空載體轉(zhuǎn)化的對照材料TRV:00 無顯著區(qū)別， 說明GhSAG101在幼苗時(shí)期不影響棉花的生長發(fā)育。 在VIGS 注射后10 d 時(shí)用qRT-PCR 技術(shù)檢測GhSAG101基因的沉默效率，結(jié)果顯示GhSAG101沉默的棉花葉片中該基因的表達(dá)量僅為對照植株葉片中表達(dá)量的1/5，基因沉默效果顯著（圖3A）。 由于GhSAG101A和GhSAG101D基因高度同源，根據(jù)VIGS 技術(shù)的原理無法單獨(dú)沉默GhSAG101A或者GhSAG101D， 因此本研究中構(gòu)建的VIGS 載體同時(shí)沉默了GhSAG101A和GhSAG101D的表達(dá)。

將注射pTRV2 和pTRV2∷SAG101 后3 周的棉花幼苗用傷根法接種V991 孢子液， 在接種4～5 d 后，2 種材料都開始出現(xiàn)黃萎病的典型病征，包括葉片黃化和萎蔫。 隨著黃萎病菌在維管組織中的擴(kuò)散和釋放毒素，棉花病害加重。 在侵染后持續(xù)觀察2 種材料的病癥， 發(fā)現(xiàn)pTRV2 處理的棉苗隨后的病程進(jìn)展快于pTRV2-SAG101處理的。pTRV2 處理的棉花葉片黃化、枯萎明顯，而pTRV2-SAG101 處理的棉花葉片黃化、枯萎程度較輕（圖3C）。在接種后10 d，pTRV2 處理的棉苗發(fā)病率達(dá)到了58%，pTRV2-SAG101 處理的棉苗發(fā)病率為32%； 病情指數(shù)也存在類似的差異，在接種后10 d，pTRV2 和pTRV2∷SAG101 處理的棉苗病情指數(shù)分別為21 和10（圖3B）。

圖3 TRV:00 和TRV:SAG101 幼苗的抗病性分析Fig. 3 Disease resistance assay of TRV:00 and TRV:SAG101 seedlings

黃萎病菌從寄主根部入侵，在維管組織中從下往上擴(kuò)展， 堵塞導(dǎo)管和分泌毒素殺死鄰近細(xì)胞。 通常發(fā)病植株莖、葉柄和側(cè)枝的維管束會變成褐色或黑褐色。 因此，剖稈觀察維管束是初步判斷大田棉花是否感染黃萎病的指標(biāo)之一[33]。 在接種后15 d，對對照棉株（TRV:00）和基因沉默棉株（TRV:SAG101）莖稈同一部位維管組織的觀察結(jié)果 （圖4） 顯示， 兩者都出現(xiàn)維管褐化現(xiàn)象，TRV:00 的褐化程度重于TRV:SAG101， 說明在同等條件下， 黃萎病菌在TRV:00 中造成了更嚴(yán)重的擴(kuò)散和細(xì)胞死亡。以上結(jié)果暗示，GhSAG101負(fù)調(diào)控棉花對黃萎病的抗性。

圖4 TRV:00 和TRV:SAG101 接菌后15 d 的莖部觀察Fig. 4 Observation of the stems of TRV:00 and TRV:SAG101 at 15 d after V. dahliae infection

2.4 GhSAG101 調(diào)控黃萎病菌在棉花中的擴(kuò)散

選同一部位、 長勢一致的TRV:00 和TRV:SAG101 葉片接種黃萎病菌并進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過每天測定黃萎病菌引起的病斑大小來定量黃萎病菌擴(kuò)散情況[32]。 在接菌后3 d，可以觀察到TRV:00 葉片上的病斑比TRV:SAG101 擴(kuò)展更快，2 個(gè)材料間的病斑大小差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平（圖5A）。 在接菌后5 d 和7 d，TRV:00 葉片的病斑面積分別是TRV:SAG101 葉片病斑面積的1.4 和1.1 倍（圖5A）。 說明沉默GhSAG101在一定程度上抑制了黃萎病菌在棉花葉脈組織中的擴(kuò)散。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)論，利用帶綠色熒光標(biāo)簽的強(qiáng)致病力黃萎病菌菌系Vd592-GFP對其入侵過程進(jìn)行了可視化研究。 在接菌后1 d，TRV:00 和TRV:SAG101 離體葉片上都觀察到帶綠色熒光的菌絲沿著葉脈向外擴(kuò)散， 但在TRV:00 組織中定植的菌絲更多（圖5B）。

圖5 TRV:00 和TRV:SAG101 離體葉片的抗病性分析Fig. 5 Disease resistance assay by using the detached leaves of TRV:00 and TRV:SAG101

3 討論

研究棉花抗病分子機(jī)理、 挖掘抗病相關(guān)基因、創(chuàng)制棉花抗病新種質(zhì)，是棉花育種的主要目標(biāo)之一[35-36]。VIGS 作為一種簡單、快捷的技術(shù)，對于棉花等遺傳轉(zhuǎn)化周期長、 工作量大的作物而言， 可以快速得到目標(biāo)基因表達(dá)水平降低的材料，在棉花抗病基因的功能分析上有重要的作用[10,14,31]。 本研究克隆到1 對受黃萎病菌誘導(dǎo)的同源基因GhSAG101A和GhSAG101D， 通過VIGS 技術(shù)沉默了棉花的GhSAG101基因， 并用qRT-PCR 技術(shù)驗(yàn)證了本研究中VIGS 有效性。 對GhSAG101沉默和對照棉花材料進(jìn)行整株接種黃萎病菌，然后對其病情指數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)沉默GhSAG101的棉花植株對黃萎病抗性顯著提高。對棉花離體葉片接菌后觀察發(fā)現(xiàn)， 在GhSAG101沉默植株的葉片中，菌絲擴(kuò)散速度顯著低于對照材料。這些研究結(jié)果證實(shí)了GhSAG101基因負(fù)調(diào)控棉花對黃萎病菌的抗性，今后可以通過規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）技術(shù)在棉花中敲除GhSAG101基因來創(chuàng)制棉花抗病新種質(zhì)[35-37]。

SAG101 屬于EDS1 蛋白家族， 該蛋白家族成員廣泛存在于植物中，在免疫信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。 EDS1 蛋白家族， 調(diào)控植物激素和NLR 蛋白介導(dǎo)的免疫信號，對植物抵抗活體營養(yǎng)型病原菌尤其重要[38-39]。 擬南芥和煙草Nicotiana tabacum中EDS1基因的進(jìn)化分析與功能研究發(fā)現(xiàn)，EDS1-SAG101 異源二聚體介導(dǎo)細(xì)胞死亡和免疫反應(yīng)[40]。 Zhang 等[11]在海島棉G.barbadense中沉默GbEDS1基因，可顯著降低棉花對黃萎病菌的抗性和水楊酸、H2O2的積累水平； 在擬南芥中異源表達(dá)GbEDS1則可誘導(dǎo)水楊酸和H2O2的合成，增強(qiáng)了擬南芥的抗病性，說明EDS1正調(diào)控棉花對黃萎病菌的抗性。 然而，在本研究中沉默GhSAG101增強(qiáng)了棉花對黃萎病菌的抗性，說明GhSAG101是棉花抗黃萎病的負(fù)調(diào)控因子，與GhEDS1的功能相反。 根據(jù)以上結(jié)果， 我們推測EDS1和SAG101在擬南芥中存在的協(xié)同抗病作用在棉花中可能受到影響。

在擬南芥中，SAG101在開始衰老的葉片中表達(dá)。 誘導(dǎo)SAG101過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因擬南芥附著葉和離體葉片均表現(xiàn)出早衰現(xiàn)象[28]。 說明SAG101在葉片衰老過程中發(fā)揮重要作用， 且目前未證明該功能與EDS1相關(guān)[28]。 在黃萎病菌侵染的中后期，病原菌擴(kuò)散到衰老組織，并從活體營養(yǎng)型轉(zhuǎn)變?yōu)樗荔w營養(yǎng)型，寄主植物出現(xiàn)生長發(fā)育遲緩和葉片黃化等典型癥狀[41-42]。 葉片黃化、脫落等病理性早衰現(xiàn)象是棉花黃萎病發(fā)病的典型病征[43]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)黃萎病菌侵染擬南芥后，會誘導(dǎo)衰老相關(guān)基因SAG12、SAG13和WRKY53等的表達(dá)變化[44-45]，早衰有助于黃萎病菌在死體營養(yǎng)型階段的擴(kuò)散和定植[42-43,46]。棉花GhSAG101在接種的中后期在根系上調(diào)表達(dá)可能是黃萎病菌誘導(dǎo)棉花的衰老造成的。 葉片接種試驗(yàn)通常在避光環(huán)境下進(jìn)行，暗處理可能會誘導(dǎo)加劇葉片衰老進(jìn)程，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)GhSAG101的表達(dá)。 在接種黃萎病菌后，水處理對照材料中的GhSAG101表達(dá)量上調(diào)； 而在GhSAG101沉默的材料中，接菌的誘導(dǎo)作用會被抑制， 這些可能是接菌后TRV: SAG101 葉片比TRV: 00 葉片更抗黃萎病菌擴(kuò)散的原因。沉默GhSAG101會顯著降低棉花的發(fā)病率和病情指數(shù)，可能是由于衰老途徑被抑制， 從而影響了黃萎病菌侵染的結(jié)果。 研究GhSAG101基因在棉花抗黃萎病中的功能和作用機(jī)理，可為棉花抗病育種提供理論基礎(chǔ)和候選基因， 但GhSAG101在棉花中如何調(diào)控抗病反應(yīng)，以及是否可以通過抑制早衰來增強(qiáng)棉花的抗病性有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

從棉花中克隆到1 對EDS 蛋白家族的同源基因GhSAG101A和GhSAG101D， 表達(dá)模式分析表明GhSAG101基因在根中表達(dá)量最高，在葉中最低；GhSAG101響應(yīng)黃萎病菌入侵， 在其侵染的中后期被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。 通過VIGS 沉默及抗病性分析發(fā)現(xiàn)，沉默GhSAG101會增強(qiáng)棉花對黃萎病菌的抗性， 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默GhSAG101能抑制棉花體內(nèi)黃萎病菌的擴(kuò)散。 綜上所述，GhSAG101基因負(fù)調(diào)控棉花對黃萎病菌的抗性，可作為抗病育種的候選基因。