GhEIN3 基因?qū)γ藁菸∶{迫響應(yīng)的功能分析

趙曾強(qiáng)，張析，李瀟玲，張薇*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832000；2. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院生物技術(shù)研究所，新疆 石河子 832000）

乙烯（ethylene, ET）不敏感蛋白3（ethyleneinsensitive 3，EIN3）和EIN3-like（EIL）蛋白是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中重要的核轉(zhuǎn)錄因子，其C 端保守性較低，N 端高度保守，包含酸性氨基酸區(qū)、脯氨酸富集區(qū)、堿性氨基酸區(qū)等，含有DNA 結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域，能與初級(jí)乙烯響應(yīng)元件（primary ethylene reaction element, PERE）結(jié)合調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，參與生物與非生物脅迫響應(yīng)[1-3]。 目前關(guān)于該類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子基因的研究主要在擬南芥（Arabidopsis thaliana）[4]（6 個(gè)成員）、 煙草（Nicotiana tabacum）[5-6]（5 個(gè)成員）、 番茄（Lycopersicon esculentum）[7-8]（4 個(gè)成員）、水稻（Oryza sativa）[9-10]（6 個(gè)成員）等植物中，通過(guò)擬南芥建立的乙烯響應(yīng)的線性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)模型研究表明，EIN3/EIL家族基因是乙烯信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因[11-12]。

在擬南芥中，乙烯受體蛋白（ethylene receptor 1, ETR1; ethylene receptor 2, ETR2）、乙烯響應(yīng)傳感蛋白（ethylene response sensor 1, ERS1; ethylene response sensor 2, ERS2）、 乙烯不敏感蛋白4（ethylene-insensitive 4, EIN4） 等是膜相關(guān)受體蛋白的主要組成成分，能夠感知乙烯信號(hào)并負(fù)調(diào)控該途徑，膜相關(guān)受體的激活態(tài)或失活態(tài)與乙烯的結(jié)合有關(guān)[13-15]。 研究表明，無(wú)乙烯存在時(shí)，膜相關(guān)受體的激活態(tài)與負(fù)調(diào)控因子組成型三重響應(yīng)蛋白1（constitutive triple response 1, CTR1）結(jié)合，通過(guò)促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）途徑將信號(hào)傳遞至EIN2，從而抑制由EIN2 和EIN3 介導(dǎo)的信號(hào)通路應(yīng)答[16-17]。 乙烯存在時(shí)，膜相關(guān)受體（如ETR1/2 等）失活，不能與CTR1 結(jié)合，CTR1 抑制下游乙烯響應(yīng)開(kāi)啟，從而使EIN3 蛋白在細(xì)胞核快速積累，參與調(diào)控或激活下游其他轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)[16, 18-20]。

EIN3/EIL家族基因是否參與植物抗逆響應(yīng)？據(jù)研究報(bào)道，擬南芥ein3-1和eil1-1雙突變體對(duì)高濃度鹽的耐受性顯著降低[21]。 陳華民[22]發(fā)現(xiàn)EIN3 通過(guò)負(fù)調(diào)控水楊酸（salicylic acid, SA）信號(hào)通路調(diào)控植物的先天免疫反應(yīng)； 在大豆（Glycine max）中過(guò)表達(dá)EIN3-1、EIN3-2能明顯增強(qiáng)植株對(duì)大豆疫霉根腐病的抗性[23]；從矮牽牛（Petunia hybrida）中分離得到的3 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子PhEIL1～3中，只有PhEIL1受乙烯的誘導(dǎo)[24]。 研究表明，病程相關(guān)（pathogenesis-related, PR）蛋白在植物抗病反應(yīng)中具有重要意義[25]。乙烯是重要的信號(hào)分 子，EIN2、EIN3、EIN5/AIN1、EIN6、EIN7 是 乙烯響應(yīng)的正調(diào)控因子，負(fù)責(zé)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而定位于核內(nèi)的DNA 結(jié)合蛋白EIN3，直接作用于乙烯響應(yīng)因子1（Ethylene response factor 1, ERF1），調(diào)節(jié)乙烯響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄， 激活植物防御素和PR基因表達(dá)，激活植物的抗病性反應(yīng)[26]。 棉花（Gossypium）基因組分析揭示，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因涉及2 個(gè)途徑[27]，EIN3 和EIL 是相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。韓利紅[28]將GhEIN3基因?qū)霐M南芥，并獲得過(guò)表達(dá)該基因的擬南芥， 黑暗條件下用1- 氨基環(huán)丙烷-1- 羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC）對(duì)其進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)GhEIN3的擬南芥植株的下胚軸短于野生型和雙突變體ein3eil1，表明GhEIN3在擬南芥中能夠響應(yīng)乙烯信號(hào)；Wang 等[29]發(fā)現(xiàn)GhEIN3參與棉花耐鹽性調(diào)控。

棉花枯萎病是嚴(yán)重影響海島棉（G.barbadense）品質(zhì)及產(chǎn)量的土傳真菌病害之一，而關(guān)于棉花中是否存在響應(yīng)枯萎病菌脅迫表達(dá)的EIN3/EIL 轉(zhuǎn)錄因子基因的研究報(bào)道甚少。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing, VIGS）技術(shù)不需遺傳轉(zhuǎn)化，能夠在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因沉默，被開(kāi)發(fā)為快速、高效、高通量的反向遺傳學(xué)技術(shù)， 在棉花基因功能研究中得到廣泛應(yīng)用[30]。

VIGS 技術(shù)利用注射等方式接種棉花子葉， 操作簡(jiǎn)單，不受基因型限制，沉默效率高，約2 周便可實(shí)現(xiàn)靶基因沉默，可大幅縮短研究周期[31-33]。 因此，本研究通過(guò)分析枯萎病菌誘導(dǎo)棉花根部基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)獲得EIN3/EIL 轉(zhuǎn)錄因子基因GhEIN3，利用生物信息學(xué)工具、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （quantitative real time polymerase chain reaction, qRT-PCR）技術(shù)和VIGS 技術(shù)初步分析該基因參與調(diào)控棉花對(duì)枯萎病抗性的途徑，以期為進(jìn)一步研究其功能提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

棉花材料：抗枯萎病陸地棉（G.hirsutum）品種中棉所12；枯萎病菌：強(qiáng)致病力菌株7 號(hào)生理小種F430[34]；VIGS 載體pTRV1 與pTRV2 載體由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院劉慧英老師惠贈(zèng)；pTRV2∷GhCLA1 重組載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 材料種植

選籽粒飽滿的種子，經(jīng)10%（體積分?jǐn)?shù)）過(guò)氧化氫浸泡3 h，無(wú)菌水沖洗5～6 次后種植于無(wú)菌蛭石中，待棉苗根部生長(zhǎng)至3 cm 左右，移入霍格蘭氏（Hogland's）溶液，置于25 ℃、光照16 h/ 黑暗8 h 的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并每周更換溶液[35]。

1.3 材料處理

枯萎病接菌處理：種植棉苗400 余株，在生長(zhǎng)過(guò)程中去除弱苗與長(zhǎng)勢(shì)不一致的棉苗，待棉苗第1 片真葉完全展開(kāi)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗傷根后浸泡于孢子含量為1×107mL-1的枯萎病菌孢子懸浮液中40 min， 而后轉(zhuǎn)入霍格蘭氏溶液培養(yǎng)[36]。分別取未處理（CK）和處理后1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 的棉苗完整根部組織，同時(shí)設(shè)置平行對(duì)照（Mock），即相同生長(zhǎng)環(huán)境下相同取樣時(shí)間的清水處理棉苗根部組織，共處理棉苗150 余株，樣品經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用[3]。

激素處理： 待棉苗第1 片真葉完全展開(kāi)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗分別浸泡于含有1×10-3mol·L-1乙烯、5×10-5mol·L-1SA、1×10-3mol·L-1茉莉酸（jasmonic acid，JA）和不添加任何激素的清水（Mock）中40 min，然后轉(zhuǎn)移至新鮮霍格蘭氏溶液中，分別取未處理（CK）和處理后1 h、2 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h 的棉苗完整根部組織，共處理棉苗200 余株， 樣品經(jīng)液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱備用[3]。

1.4 GhEIN3 基因克隆及表達(dá)特征分析

1.4.1GhEIN3 基因克隆及序列分析。 棉花根部總RNA 的提取采用改良的CTAB 方法[37]，cDNA第1 鏈的合成參考TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。GhEIN3基因擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸4 min，32 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 將陽(yáng)性菌株送至生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。 擴(kuò)增引物為GhEIN3-F：GCTCTAGAATGATGATGTTTGACGAGATGGG，GhEIN3-R：CGAGCTCCTGGAACCAGATTGAAACATCC。

利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）ORF finder 分 析 開(kāi) 放 閱 讀 框（open reading frame, ORF）；利用SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1） 進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析； 利用GOR4（http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html）進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用SWISS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域三級(jí)結(jié)構(gòu)的同源建模分析；利用ExPaSy ProtScale（http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl） 進(jìn)行蛋白親/疏水性分析；利用ExPaSy ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析；利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/） 對(duì)GhEIN3基 因 上 游2 000 bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析； 利用NCBI 中的Blast 程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM = blastp ＆ PAGE _ TYPE = Blast-Search ＆LINK_LOC=blasthome） 進(jìn)行同源性比對(duì)，數(shù)據(jù)庫(kù)選擇非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Nonredundant protein sequence, NR）， 參數(shù)為程序默認(rèn)設(shè)置，獲得的同源序列登錄號(hào)見(jiàn)表1。獲得的序列利用Mega 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析， 利用DNAMAN 6.0 軟件進(jìn)行同源性比較。

表1 GhEIN3 基因同源序列Table 1 Homologous sequences of GhEIN3 gene

1.4.2GhEIN3 基因表達(dá)特征分析。 選取在棉花根和葉中表達(dá)穩(wěn)定的GhUBQ7（DQ116441）作為內(nèi)參基因[38]，qRT-PCR 反應(yīng)體系及程序參見(jiàn)TaKaRa 公司（大連）TB GreenPremix EX TaqTM說(shuō)明書(shū)；設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[39]。 所用引物為qGhEIN3-F：GCCCTTACAGTGAATTTCGTT，qGhEIN3-R：TACTGACATGAGTTCGCCGAT；GhUBQ7-F：GAAGACCTACACCAAGCCCAA，GhUBQ7-R：CGGACT CTACTC AATCCCCACC。

1.5 VIGS 載體的構(gòu)建

根據(jù)GhEIN3基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，利用PCR 擴(kuò)增目標(biāo)片段， 采用酶切連接法進(jìn)行VIGS 載體構(gòu)建， 將構(gòu)建好的pTRV2∷GhEIN3重組載體通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌GV3101，對(duì)菌液采用PCR 技術(shù)篩選鑒定陽(yáng)性菌株。 所用引物為GhEIN3-V-XbaI-F：GCTCTAGATGATCCTCCTCAAAGGCGAT，GhEIN3-V-KpnI-R：GGGGTACCCAAAG TTCGGCTCATCTTCAAC，下劃線示限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。

1.6 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的VIGS 基因沉默與沉默植株抗病觀察及相關(guān)基因表達(dá)的檢測(cè)

VIGS 試驗(yàn)操作參考棉花病毒誘導(dǎo)的基因沉默體系及優(yōu)化方法[40]。GhEIN3沉默植株枯萎病抗病性鑒定：以注射pTRV2∷GhCLA1 的棉花葉片出現(xiàn)報(bào)告基因GhCLA1導(dǎo)致的白化表型后，對(duì)基因沉默的棉苗（記為T(mén)RV-GhEIN3）和對(duì)照棉苗，進(jìn)行傷根處理，并對(duì)每株棉苗接種孢子數(shù)為（注射空載體pTRV2∷00 的棉花，記為mock）1×107mL-1的枯萎病菌孢子懸浮液10 mL，然后在溫度25 ℃/23 ℃（光照/黑暗）、光照16 h/黑暗8 h，相對(duì)濕度75%條件下培養(yǎng)，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 株，定期觀察發(fā)病情況。

沉默株系中抗病相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)方法：沉默植株接菌及培養(yǎng)條件同抗病性鑒定。 所檢測(cè)的抗病相關(guān)基因包括GhERF1（XM_016876293.1）、GhACO（ NM_001326965 . 1 ） 、GhPR1（ XM_016882081.1）、GhPR2（XM_016813433.1）、Gh PR4（XM_016893098.1）、GhPR5（XM_016893098.1）。試驗(yàn)選取在棉花根和葉中表達(dá)穩(wěn)定的GhUBQ7（DQ116441）設(shè)計(jì)內(nèi)參引物[38]，qTR-PCR 反應(yīng)體系及程序參見(jiàn)TaKaRa 公司（大連）TB GreenPremix EX TaqTM說(shuō)明書(shū)，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[39]，利用Olig 7 軟件設(shè)計(jì)上述基因引物，其序列見(jiàn)表2。

表2 引物及其序列Table 2 Primer and their sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 GhEIN3 基因克隆與序列分析

利用枯萎病菌誘導(dǎo)棉花根部基因表達(dá)譜和棉花數(shù)據(jù)庫(kù)從陸地棉中篩選獲得1 個(gè)ORF 完整且編碼氨基酸序列含有典型EIN3 蛋白結(jié)構(gòu)域的基因（圖1A、B）；以棉花根部組織cDNA 為模板，通過(guò)PCR 擴(kuò)增及測(cè)序分析， 基因ORF 全長(zhǎng)為1 842 bp（Genbank 登錄號(hào)：KY744279，圖1A），編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為69 609.64，等電點(diǎn)為5.41，為親水不穩(wěn)定蛋白，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，無(wú)規(guī)則卷曲的比例較高，為55.79%，是其二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成元件（圖1C）；啟動(dòng)子序列分析表明，除啟動(dòng)核心元件和光響應(yīng)元件外，還包括干旱響應(yīng)元件，SA、脫落酸及赤霉素響應(yīng)元件，低溫響應(yīng)元件，MYB 結(jié)合位點(diǎn)和DNA 結(jié)合蛋白位點(diǎn)（圖1D）。 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，GhEIN3與澳洲棉KAA3468812.1親緣關(guān)系較近（圖2）；同源比對(duì)分析表明，GhEIN3編碼的氨基酸序列與同源基因編碼的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域主要集中在N 端（圖3）。

圖1 GhEIN3 基因克隆及序列分析Fig. 1 Clone and sequence analysis of GhEIN3 gene

圖2 GhEIN3 基因與其他植物EIN3/EIL 基因編碼的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Phylogenetic tree of amino acid sequences encoded by GhEIN3 and EIN3/EIL genes in other plants

圖3 GhEIN3 基因與其他EIN3 基因編碼的氨基酸序列的同源比對(duì)結(jié)果Fig. 3 Alignment of deduced amino acid sequences of GhEIN3 and the other related EIN3 genes

2.2 GhEIN3 基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

枯萎病菌侵染后，GhEIN3在各處理時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量均高于Mock（圖4A）；其中處理后24 h， 該基因的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值， 是Mock 的3.72 倍（差異顯著），顯示該基因能被枯萎病菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因參與棉花枯萎病脅迫響應(yīng)。

為了進(jìn)一步檢測(cè)GhEIN3基因是否對(duì)激素信號(hào)具有應(yīng)答響應(yīng)， 對(duì)抗病品種中棉所12 的棉苗分別用3 種激素（SA、JA 和ET）處理。 基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果顯示：ET 處理后，該基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)， 在處理后3 h達(dá)到峰值，且為同時(shí)期Mock 的5.43 倍，差異極顯著（圖4B）；SA 與JA 處理后，該基因的表達(dá)模式相似，SA 處理后6 h 開(kāi)始其表達(dá)量均低于Mock，JA 處理后其表達(dá)量均低于Mock， 在SA處理后48 h 與JA 處理后24 h 時(shí)，GhEIN3的表達(dá)量最低， 分別為Mock 的5.54%和2.07%（圖4C、D）。 據(jù)此推測(cè)，ET 對(duì)GhEIN3基因的表達(dá)為正調(diào)控，SA 與JA 對(duì)GhEIN3基因的表達(dá)為負(fù)調(diào)控。

圖4 不同脅迫處理后GhEIN3 基因的表達(dá)模式Fig. 4 Expression pattern of Ghein3 gene under different stresses

2.3 GhEIN3 基因VIGS 載體構(gòu)建

以棉花根部組織的cDNA 為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，片段為400 bp（圖5A），回收產(chǎn)物連接T 載體并進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖5B）并進(jìn)行測(cè)序，選擇正確的重組質(zhì)粒，采用酶切連接的方法進(jìn)行VIGS 載體構(gòu)建，對(duì)重組載體pTRV2∷GhEIN3 進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖5C），結(jié)果均與預(yù)期相一致，表明成功構(gòu)建了該基因沉默重組載體pTRV2 ∷GhEIN3。 然后用其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖5 pTRV2∷GhEIN3 載體的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of pTRV2∷GhEIN3 vector

2.4 GhEIN3 基因沉默效率及沉默植株抗病性檢測(cè)

注射后10 d，pTRV2∷GhCLA1 處理植株真葉出現(xiàn)白化現(xiàn)象（圖6A），表明VIGS 體系可以成功抑制報(bào)告基因GhCLA1表達(dá)，且該體系能夠用于棉花中基因功能研究。 在棉苗注射pTRV2∷GhEIN3 后10 d，GhEIN3基因表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果表明，GhEIN3基因在沉默植株中的表達(dá)量為注射空載體植株的16.42%，由此可知，沉默效率約84%（圖6B）。 傷根法接菌后14 d，沉默植株下部葉片快速萎蔫變黃然后變枯，與對(duì)照相比，沉默植株較感?。▓D6C～F）。

圖6 GhEIN3 基因沉默效率及沉默植株抗病檢測(cè)結(jié)果Fig. 6 Silencing efficiency of GhEIN3 gene and detection of disease resistance in silenced plants

2.5 沉默株系中抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析

PR1、PR2、PR4、PR5基因表達(dá)分析結(jié)果 （圖7）表明，在沉默株系中PR1、PR2、PR4的相對(duì)表達(dá)量均低于空載體對(duì)照，分別低50%、28%、30%，而PR5的相對(duì)表達(dá)量高于空載體對(duì)照46%；乙烯合成及信號(hào)通路相關(guān)基因ACO和ERF1在沉默植株中的相對(duì)表達(dá)量均顯著低于空載體對(duì)照。 由以上結(jié)果推測(cè)，GhEIN3基因通過(guò)調(diào)控病程相關(guān)基因與乙烯信號(hào)通路關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控棉花對(duì)枯萎病的抗性。

圖7 GhEIN3 基因沉默植株接種F430 后抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析Fig. 7 Expression analysis of disease resistance related genes in GhEIN3-silenced plants infected with F430

3 討論

乙烯在植物生長(zhǎng)發(fā)育及逆境應(yīng)答中發(fā)揮重要的作用， 而EIN3 和EIL 是乙烯信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，EIN3 能夠特異性結(jié)合乙烯響應(yīng)相關(guān)基因啟動(dòng)子的特定DNA 序列， 進(jìn)而激活這些基因的轉(zhuǎn)錄，參與植物抗逆響應(yīng)[41]。

本研究根據(jù)枯萎病菌誘導(dǎo)棉花基因表達(dá)譜在棉花基因組中鑒定出響應(yīng)枯萎病菌的轉(zhuǎn)錄因子GhEIN3基因，ORF 全長(zhǎng)為1 842 bp，編碼613個(gè)氨基酸， 所編碼氨基酸中含有典型EIN3 結(jié)構(gòu)域，枯萎病菌侵染后，基因表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)其參與了棉花抗枯萎病響應(yīng)。 前人研究表明，過(guò)表達(dá)EIN3-1、EIN3-2的大豆植株對(duì)大豆疫霉根腐病的抗性明顯增強(qiáng)[23]；油菜（Brassica napus）中BnEIN3基因能被核盤(pán)菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)， 且其在高抗病品種中的表達(dá)水平顯著高于中抗病品種和感病品種[42]。 以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

研究表明，SA、JA 和ET 是植物抗逆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要信號(hào)分子[43-44]。 研究使用外源激素SA、JA 和ET 分別處理棉花幼苗，利用qRT-PCR技術(shù)分析GhEIN3基因表達(dá)特征， 結(jié)果表明，施加ET 后，GhEIN3基因在各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均高于同時(shí)期Mock，說(shuō)明其為ET 通路中的正調(diào)控因子， 也與前人對(duì)該基因家族研究結(jié)果一致；但施加SA、JA 后， 該基因表達(dá)量整體低于Mock，表明SA、JA 抑制GhEIN3基因表達(dá)。 研究顯示，SA 與ET 之間存在拮抗關(guān)系[45]，而EIN3 在病原微生物脅迫下， 同時(shí)能負(fù)調(diào)控SA 生物合成途徑關(guān)鍵基因SID2的表達(dá)[22]，也能夠抑制JA 途徑誘導(dǎo)的煙堿合成酶基因表達(dá)[46]，推測(cè)該基因可能是SA 與ET 拮抗作用的節(jié)點(diǎn)。 大部分研究認(rèn)為，JA 與ET 兩個(gè)信號(hào)通路協(xié)同作用， 共同調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)； 但也有研究表明，ET 與JA 之間也存在拮抗作用，ET 能夠抑制JA 途徑中THI2.1、VSP等關(guān)鍵基因的表達(dá)[47]，暗示各個(gè)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑所構(gòu)成的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中存在復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用，而并不是單一的拮抗或者協(xié)同作用。GhEIN3基因在SA、JA 和ET 信號(hào)通路交互過(guò)程中所起到的作用也有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，SA 通路為SA→NPR1→TGA→PR1→抗病，NPR1基因是多種信號(hào)途徑的交叉點(diǎn)，通過(guò)與TGA 轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)控PR基因 表 達(dá)[48]；EIN3和EIN3-Like1 基 因 通 過(guò) 抑 制SID2編碼的ICS1 表達(dá)而負(fù)調(diào)控病原菌誘導(dǎo)的SA 合成[49]。白樺中，抑制BpEIN3表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株中參與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因、SA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的NPR1基因和JA 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控基因JAZ10均上調(diào)表達(dá)[50]，而NPR1 最早被發(fā)現(xiàn)在擬南芥中正向調(diào)控SA 信號(hào)通路中PR基因的表達(dá)[51]，由此推測(cè)，EIN3/EIL1 通過(guò)負(fù)調(diào)控SID2基因的表達(dá)調(diào)節(jié)植物體SA 合成，進(jìn)而調(diào)控PR基因表達(dá)， 影響植物抗病性。 本研究利用VIGS 技術(shù)在高抗枯萎病棉花品種中棉所12 中沉默GhEIN3基因，其沉默效率較高，且接菌試驗(yàn)表明沉默株系明顯感??；對(duì)病程相關(guān)基因的表達(dá)量分析結(jié)果顯示， 沉默株系中PR5表達(dá)量高于對(duì)照， 而PR1、PR2、PR4表達(dá)量均低于對(duì)照， 暗示GhEIN3基因能夠調(diào)控PR基因表達(dá)。 但是，本研究采用的VIGS 技術(shù)只能降低GhEIN3基因的表達(dá)量（基因表達(dá)量約為未沉默株系的14%），無(wú)法完全抑制其表達(dá)，所以根據(jù)上述結(jié)果僅能初步推斷GhEIN3基因參與并響應(yīng)枯萎病侵染棉花的過(guò)程，而對(duì)于該基因是否如前人研究一樣通過(guò)調(diào)控SA 合成關(guān)鍵基因SID2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)棉花對(duì)枯萎病的抗性有待后續(xù)研究。

ERF 是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白 （ethylene responsive element binding protein, EREBP）的成員之一，離體和活體試驗(yàn)均證實(shí)EIN3 與特定ERF1啟動(dòng)子的原初響應(yīng)元件結(jié)合形成二聚體，調(diào)節(jié)ERF1轉(zhuǎn)錄[26]。 本研究沉默GhEIN3基因的植株中，ERF1基因的表達(dá)低于對(duì)照， 由此推斷GhEIN3基因?qū)RF1基因具有調(diào)控作用。ACO基因是編碼ACC 氧化酶的關(guān)鍵基因，ACC 氧化酶是ET 合成過(guò)程中重要的氧化酶[52]，而ACO 酶活性下降，可以降低內(nèi)源乙烯合成速度[53]。 本研究結(jié)果顯示，GhEIN3基因?yàn)镋T 信號(hào)通路中的正調(diào)控因子， 且GhEIN3基因沉默株系中，ACO基因的表達(dá)量下降，由此推測(cè)GhEIN3基因可能通過(guò)調(diào)控ACO基因表達(dá)調(diào)節(jié)ACC 的合成影響棉花內(nèi)源乙烯合成， 進(jìn)而影響棉花對(duì)枯萎病的抗性。

本研究就GhEIN3在不同脅迫處理下的表達(dá)特征、GhEIN3沉默后植株的抗病性與GhEIN3沉默后抗病相關(guān)基因的表達(dá)做了初步研究，為解析棉花中GhEIN3參與調(diào)控棉花對(duì)枯萎病菌抗性的機(jī)理提供了新的基礎(chǔ)信息； 植物中EIN3基因是2 個(gè)相關(guān)乙烯途徑的重要基因， 而GhEIN3如何具體參與調(diào)控棉花響應(yīng)枯萎病菌脅迫仍有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究從陸地棉中鑒定出1 個(gè)新的能夠響應(yīng)枯萎病菌和激素脅迫的EIN3/EIL基因家族成員GhEIN3，全長(zhǎng)1 842 bp，含有典型的EIN3 蛋白結(jié)構(gòu)域， 能夠響應(yīng)枯萎病菌、ET、JA 和SA 脅迫， 經(jīng)ET 與JA 誘導(dǎo)后，GhEIN3基因的整體表達(dá)水平分別顯著上調(diào)和下調(diào)。 通過(guò)VIGS 技術(shù)沉默GhEIN3的棉株中PR1、PR2、ERF1、ACO基因表達(dá)水平顯著降低，沉默棉株對(duì)枯萎病的抗性減弱，表明GhEIN3基因在棉花抗枯萎病的過(guò)程中起積極作用。