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    多囊卵巢綜合征患者子宮內(nèi)膜病變的基因表達(dá)譜*

    2022-08-08 10:56:52李小芳李潔明金文艷陳秋平周香城張小偉周嘉禾鐘明琳
    關(guān)鍵詞:差異基因內(nèi)膜途徑

    李小芳,胡 克,李潔明,金文艷,陳秋平,周香城,張小偉,周嘉禾,鐘明琳,李 荔

    (1.廣東省婦幼保健院婦科,廣州 510000;2.廣東省婦幼保健院婦女兒童健康研究所,廣州 510000;3.廣州醫(yī)科大學(xué),廣州 510000)

    多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是育齡期婦女一種常見的內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。PCOS患者因稀發(fā)排卵或閉經(jīng)使子宮內(nèi)膜長(zhǎng)期處于增殖狀態(tài),導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生病變甚至癌變。PCOS導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增生相關(guān)病變的具體發(fā)病機(jī)制仍不清楚,危險(xiǎn)因素尚不明確。深入研究PCOS子宮內(nèi)膜增生病變的相關(guān)危險(xiǎn)因素是近年來的臨床研究熱點(diǎn)。早期研究者多關(guān)注于相關(guān)蛋白分子機(jī)制水平,在已發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)蛋白或基因中進(jìn)行分析,從而驗(yàn)證出對(duì)疾病發(fā)生發(fā)展可能具有重要意義的蛋白質(zhì)或基因,繼而試圖尋找重要治療靶點(diǎn)及深入其功能水平的研究。但蛋白質(zhì)水平研究往往是片面性、單方面及多通路的,難以從根源上反映子宮內(nèi)膜病變的變化機(jī)制。子宮內(nèi)膜是一種快速循環(huán)增長(zhǎng)、分化及凋亡過程的獨(dú)特組織。在PCOS患者中,異常的激素環(huán)境及代謝失衡可調(diào)控子宮內(nèi)膜基因表達(dá)來改變子宮內(nèi)膜的穩(wěn)態(tài),尤其可促進(jìn)有缺陷的腺體和細(xì)胞增殖。隨著人類基因組測(cè)序的發(fā)展,越來越多的動(dòng)植物、微生物基因組序列得以測(cè)定,基因序列數(shù)據(jù)迅速增長(zhǎng)。本研究期望從全基因水平上深入探討PCOS患者發(fā)生子宮內(nèi)膜增生病變的分子機(jī)制。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象 選取2018年3月~2019年11月于廣東省婦幼保健院行宮腔鏡檢查+診刮術(shù)的111例PCOS患者。根據(jù)子宮內(nèi)膜病理檢查結(jié)果將患者分為子宮內(nèi)膜病變組(polycystic ovary syndrome with endometrial lesions,PCOS-EH)(37例,包括子宮內(nèi)膜息肉及息肉樣增生、子宮內(nèi)膜單純性增生、子宮內(nèi)膜復(fù)雜性增生、子宮內(nèi)膜不典型增生和子宮內(nèi)膜癌)和子宮內(nèi)膜正常組(polycystic ovary syndrome with nomal endometrium,PCOS-E)(74例,包括增殖期、分泌期)。PCOS-EH組和PCOS-E組各隨機(jī)選取10例,PCOS-EH組包括子宮內(nèi)膜單純性增生1例、子宮內(nèi)膜復(fù)雜性增生5例、子宮內(nèi)膜不典型增生3例、子宮內(nèi)膜癌1例,PCOS-E均為正常增殖期子宮內(nèi)膜。診刮取出新鮮子宮內(nèi)膜組織,裝入1.5mL的無RNase(RNA酶)的離心管,管內(nèi)有1mL RNA保存液,-20℃冰箱保存。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合2003年鹿特丹PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)[1];(2)月經(jīng)初潮后3年且年齡18~40歲;(3)PCOS患者因不孕、異常子宮出血、超聲發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜回聲異?;蜃訉m內(nèi)膜增厚(>14mm)行宮腔鏡檢查+診刮術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)絕經(jīng)期PCOS,有吸煙史;(2)近6個(gè)月使用過調(diào)節(jié)血糖血脂、激素類或避孕藥物;(3)合并慢性基礎(chǔ)疾病、急慢性感染、自身免疫性疾病及惡性腫瘤患者;(4)宮腔鏡下發(fā)現(xiàn)宮腔粘連、黏膜下子宮肌瘤或其他子宮腫瘤患者;(5)宮腔鏡手術(shù)禁忌證患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意,患者知情同意并均簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 基因表達(dá)譜的實(shí)驗(yàn)流程 基因芯片購(gòu)自上海安捷倫科技有限公司,名稱為G4102A,所用芯片規(guī)格SurePrint G3 Custom GE 8x60K,AMADID:071342。用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA,并使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳評(píng)價(jià)RNA質(zhì)量,合格的RNA樣品進(jìn)行下一步測(cè)序。合成cDNA第一鏈,使用吸附柱(Spin Columns RS)純化cRNA,并使用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)定量cRNA,雜交、組裝并洗滌芯片。

    1.2.2 數(shù)據(jù)掃描及提取 Cy3標(biāo)記的樣品用Green光掃描,Cy5標(biāo)記的樣品用Red光掃描,雙通道標(biāo)記的樣品用Green+Red掃描。Agilent掃描儀所得圖像為兩種熒光的復(fù)合圖,經(jīng)Split-tiff軟件分割成單色熒光圖像,使用Agilent Feature Extraction Software提取數(shù)據(jù),將圖像導(dǎo)入圖像分析軟件。

    1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用GeneSpring GX軟件對(duì)基因微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,顯著差異基因表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)為兩個(gè)樣品信號(hào)強(qiáng)度間的比值(ratio值)>2或<0.5(根據(jù)95%的可信區(qū)間定義)。即認(rèn)為ratio值在2~0.5范圍內(nèi)的基因不存在顯著表達(dá)差異,而ratio值>2表明該基因在PCOS子宮增生內(nèi)膜中表達(dá)顯著上調(diào),ratio值<0.5表明該基因在PCOS子宮增生內(nèi)膜中表達(dá)顯著下調(diào)。利用SAM軟件,篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異倍數(shù)>2.5及假陽(yáng)性率設(shè)置(q-value)<5%作為差異表達(dá)基因。

    1.2.4 差異表達(dá)基因的GO注釋和KEGG富集分析 將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋和KEGG信號(hào)通路富集分析,P<0.5為顯著性富集,統(tǒng)計(jì)各個(gè)term或Pathway中的差異基因數(shù)目。通過GO注釋和KEGG信號(hào)通路顯著性富集分析,確定基因表達(dá)譜中的主要基因功能和參與的主要信號(hào)通路。

    2 結(jié) 果

    2.1 基因芯片數(shù)據(jù)的差異表達(dá)基因分析(differentially expressed genes,DEGs) 有表達(dá)的基因共29871個(gè),通過差異基因分析發(fā)現(xiàn),PCOS子宮內(nèi)膜增生病變組織中存在表達(dá)差異的基因共810個(gè),其中上調(diào)基因408個(gè)(249個(gè)顯著基因),下調(diào)基因402個(gè)(344個(gè)顯著基因),見圖1。

    圖1 差異表達(dá)基因聚類分析圖

    2.2 差異基因的GO富集分析 GO生物學(xué)過程富集類別128個(gè),分子功能富集類別23個(gè),細(xì)胞組成富集類別19個(gè)。其中生物學(xué)過程中富集類別包括Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控、上皮形成、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、蛋白水解作用、MAPK的激活、基因表達(dá)的正調(diào)控、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激的細(xì)胞反應(yīng)等。分子功能富集類別包括整合素蛋白的結(jié)合、鈣離子的結(jié)合、生長(zhǎng)因子活性、基因金屬蛋白酶活性、Wnt蛋白的結(jié)合等。

    2.3 基因Pathway通路分析 利用京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)中pathway功能對(duì)差異基因進(jìn)行代謝通路分析,篩選出了23條顯著性代謝通路的差異基因,如有Wnt信號(hào)通路(hsa04310:Wnt signaling pathway)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(hsa04060:Cytokine-cytokine receptor interaction)、PI3K-Akt信號(hào)通路(hsa04151:PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號(hào)通路(hsa04010:MAPK signaling pathway)。

    通過對(duì)差異基因GO富集分析和Pathway通路分析,在生物學(xué)功能方面,Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控(q-value=4.96E-05)具有顯著差異。利用KEGG通路分析發(fā)現(xiàn),Wnt信號(hào)通路中涉及8個(gè)基因,其中2個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào)(SFRP1=-2.70、SFRP4=-4.55),6個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)(WIF1=11.88、DKK4=9.40、NKD1=8.93、WNT6=4.65、BAMBI=3.79、PRKCG=2.99),均表達(dá)顯著差異。證實(shí)Wnt信號(hào)通路分子的失調(diào)可能與PCOS子宮內(nèi)膜發(fā)生增生病變關(guān)系密切。見表1、圖2。

    表1 Wnt信號(hào)通路基因

    圖2 PCOS-EH組織中Wnt失調(diào)信號(hào)傳導(dǎo)通路注:根據(jù)NICB文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢KEGG Wnt signaling pathway所涉及的8個(gè)基因,在Wnt信號(hào)通路中推定的作用機(jī)制及途徑,其中“-”表示抑制作用,“+”表示激活作用,“?”表示該基因在Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中還具有其他的傳導(dǎo)途徑

    3 討 論

    3.1 PCOS子宮內(nèi)膜病變中存在差異表達(dá)基因 PCOS患者子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖、分化、凋亡受到各種因素的影響,如無孕激素抵抗、高雄激素、高胰島素、糖脂代謝紊亂等,這些高危因素破壞子宮內(nèi)膜正常的生理病理,促進(jìn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的有絲分裂活躍,可能導(dǎo)致植入失敗、不孕、子宮內(nèi)膜增生甚至子宮內(nèi)膜癌[2]。然而,PCOS-EH子宮內(nèi)膜發(fā)生異常增生的病理生理學(xué)的作用機(jī)制尚未探索及明確。

    目前關(guān)于PCOS正常子宮內(nèi)膜的基因表達(dá)譜已有研究報(bào)道[3],但國(guó)內(nèi)外關(guān)于PCOS子宮內(nèi)膜增生病變相關(guān)基因表達(dá)的研究尚缺乏。本研究利用全基因組芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),PCOS-EH與PCOS-E患者的子宮內(nèi)膜具有不同的基因表達(dá)譜,PCOS-EH子宮內(nèi)膜組織中存在多種差異表達(dá)基因,其中上調(diào)基因408個(gè)(249個(gè)顯著基因),下調(diào)基因402個(gè)(344個(gè)顯著基因),如明顯差異表達(dá)上調(diào)的基因有胞漿磷脂酶A2(PLA2G4D)、黏附蛋白1(MUCL1)、谷氨酸脫酸酶1(GAD1)、Wnt抑制因子1(WIF1)等,明顯差異表達(dá)下調(diào)的基因有前列腺素F受體(PTGFR)、前列腺相關(guān)蛋白4(PAGE4)、黏附蛋白1類樣蛋白1(MUM1L1)、類胰蛋白酶1(TPSAB1)等。

    3.2 PCOS子宮內(nèi)膜病變與Wnt信號(hào)通路存在相關(guān)性 研究顯示,Wnt家族成員可能與多種炎性疾病有關(guān),包括糖尿病、視網(wǎng)膜病變、炎癥性腸炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。既往研究多關(guān)注于Wnt信號(hào)通路異常表達(dá)對(duì)PCOS患者慢性炎癥、脂質(zhì)代謝[4]的影響。如有研究發(fā)現(xiàn)[5],Wnt3a低表達(dá)可能使炎癥因子的分泌增加,從而導(dǎo)致PCOS低度慢性炎癥狀態(tài)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)[6],PCOS患者卵巢顆粒細(xì)胞異常與Wnt信號(hào)通路有關(guān),Wnt/β-catenin/Foxo 3a軸為治療PCOS疾病的潛在靶點(diǎn)。參與炎癥、脂質(zhì)代謝和Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的基因在非肥胖PCOS脂肪組織中差異表達(dá),微陣列分析顯示多個(gè)Wnt信號(hào)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化,包括DKK2(增加1.9倍)、JUN(減少4.1倍)和FOSB(減少60倍)。

    本研究通過對(duì)差異基因GO富集分析和Pathway通路分析,發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路負(fù)調(diào)控(q-value=4.96E-05)具有顯著差異,2個(gè)差異基因表達(dá)下調(diào)(SFRP1=0.37、和SFRP4=0.22),6個(gè)差異基因表達(dá)上調(diào)(WIF1=11.88、DKK4=9.40、NKD1=8.93、WNT6=4.65、BAMBI=3.79、PRKCG=2.99),表達(dá)均顯著差異。證實(shí)Wnt信號(hào)通路分子的失調(diào)與PCOS子宮內(nèi)膜發(fā)生增生病變關(guān)系密切。

    3.3 PCOS子宮內(nèi)膜病變與Wnt信號(hào)通路作用機(jī)制 Wnt信號(hào)通路是一種高度保守傳導(dǎo)途徑,在許多生物發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Wnt信號(hào)通路有兩條[7],一條是經(jīng)典β-catenin依賴性通路,另外一條是非經(jīng)典β-catenin不依賴性通路,其中非經(jīng)典途徑有兩條細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)途徑:平面細(xì)胞極性通路(PCP)和Wnt/Ca2+通路。本研究發(fā)現(xiàn),激活非經(jīng)典通路的Wnt6基因、蛋白激酶C-γ(PRKCG)基因[8]表達(dá)明顯上調(diào)(FC=4.65,F(xiàn)C=2.99),證實(shí)PCOS子宮內(nèi)膜增生病變發(fā)生發(fā)展與Wnt非經(jīng)典傳導(dǎo)途徑的異常激活密切相關(guān)。

    WIF1、NKD1都是Wnt信號(hào)通路中經(jīng)典途徑的抑制劑,其功能現(xiàn)已較明確[9]。Dickkopfs蛋白家族(DKK4)表達(dá)變化有差異[10],相對(duì)其他抑制劑了解較少,在Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制作用中尚不明確。骨形成蛋白和激活素的跨膜抑制劑(BAMBI)是經(jīng)典Wnt/β-catenin途徑的正調(diào)節(jié)劑。本研究中,BAMBI表達(dá)基因上調(diào)(FC=3.79),經(jīng)典途徑的抑制因子分泌卷曲相關(guān)蛋白(SFPR1、SFPR4)表達(dá)下降,這與既往在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)研究相一致[11],表明經(jīng)典途徑的激活和抑制減少仍對(duì)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn),WIF1、NKD1抑制基因表達(dá)上調(diào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BAMBI基因的上調(diào)和SFRR1、SFPR4基因的下調(diào)(11.88、8.93 vs 0.37、0.22),在整體上可能仍表現(xiàn)為Wnt經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑的抑制。另外,SFPR4并不是單純只抑制經(jīng)典傳導(dǎo)途徑,SFPR4也能抑制Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路的非經(jīng)典途徑。Carmon等[12]也發(fā)現(xiàn),在子宮內(nèi)膜癌中,Wnt7a能通過跨膜卷曲受體(Fzd10)激活平面細(xì)胞極性/JNK依賴性非經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo),并且信號(hào)可被SFRP4抑制,SFRP4基因的下調(diào),表明非經(jīng)典途徑的抑制減少與子宮內(nèi)膜癌的腫瘤細(xì)胞侵襲作用關(guān)系密切。

    綜上所述,PCOS-EH與PCOS-E患者子宮內(nèi)膜組織中存在明顯基因表達(dá)譜差異,涉及Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)異常,且主要與Wnt信號(hào)通路的非經(jīng)典途徑激活和經(jīng)典途徑的抑制相關(guān),這組基因可作為早期預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜增生病變的生物標(biāo)記物。

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