博萊霉素對(duì)小麥的誘變效應(yīng)研究

張希太,肖磊,董策,路其祥

（邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究室,河北 邯鄲 056001）

基因突變育種是小麥遺傳改良、種質(zhì)資源創(chuàng)新與新品種培育的重要途徑,是對(duì)常規(guī)雜交育種技術(shù)的重要補(bǔ)充和不可缺少的育種手段.化學(xué)誘變技術(shù)具有成本低廉、使用方便、誘變作用專一等特點(diǎn)[1],化學(xué)誘變劑及誘變方法的選擇對(duì)化學(xué)誘變的成功與否至關(guān)重要.近半個(gè)世紀(jì)以來(lái),各國(guó)學(xué)者曾試用許多化學(xué)物質(zhì)來(lái)篩選有效低毒的化學(xué)誘變劑[1].博萊霉素（Zeocin）是世界衛(wèi)生組織確定的用于治療部分癌癥腫瘤的抗生素,其治療原理與我國(guó)的平陽(yáng)霉素基本相同,都是通過(guò)干擾阻止腫瘤細(xì)胞的DNA 復(fù)制來(lái)達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)目的.平陽(yáng)霉素是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所與華北制藥廠從浙江省平陽(yáng)縣采集的土壤中分離培養(yǎng)出的一種輪支鏈霉菌變種（Str.Verticillusvar Pinyanagensis n.var）產(chǎn)生的由10 余種成分復(fù)合而成的抗生素,經(jīng)藥物分析研究,平陽(yáng)霉素中因含有博萊霉素的A2、A5、B2成分而在臨床上具有治療癌癥腫瘤的效果[2-3].

在平陽(yáng)霉素的應(yīng)用過(guò)程中,我國(guó)科技工作者又發(fā)現(xiàn)了它對(duì)微生物、哺乳類(lèi)動(dòng)物、植物的染色體都有強(qiáng)烈的誘變作用,并逐漸應(yīng)用于部分植物的誘變育種[4-6].樸鐵夫等[7]1998 年開(kāi)始平陽(yáng)霉素誘變小麥的研究.前人用平陽(yáng)霉素誘變小麥的方法主要有以下幾種:種子處理法,1994 年和1998 年樸鐵夫等在20 ℃下,先將“吉麥2 號(hào)”小麥種子用自來(lái)水浸泡12 h 后,再在質(zhì)量濃度分別為10 μg/mL、30μg/mL、50μg/mL 劑量的平陽(yáng)霉素溶液中浸泡12 h,然后水洗2 h,晾干后進(jìn)行播種[8-9],研究了平陽(yáng)霉素質(zhì)量濃度對(duì)M1 代根長(zhǎng)、根數(shù)、苗高、出苗率、根尖細(xì)胞染色體畸形率及M2 代突變率的影響并和EMS 誘變作比較.花粉管通道法,1997 年孫德全等[10]、2011 年張希太等[11]在小麥揚(yáng)花期利用花粉管通道將平陽(yáng)霉素溶液滲透到“龍輻麥3 號(hào)”“豫麥66”的胚囊誘變合子或幼胚.孫德全試驗(yàn)表明,平陽(yáng)霉素有較強(qiáng)的誘變效應(yīng),不同質(zhì)量濃度處理對(duì)小麥的誘變效果不同,75μg/mL 時(shí)變異率較大并獲得了一些優(yōu)異突變株.張希太試驗(yàn)表明,平陽(yáng)霉素能夠使小麥在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、葉綠素含量、生育期等方面產(chǎn)生變異,在0~50μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi),隨著平陽(yáng)霉素質(zhì)量濃度的提高對(duì)小麥的誘變效應(yīng)增強(qiáng),選出了2 個(gè)變異種質(zhì)系并對(duì)誘變母體材料和變異種質(zhì)系的基因組DNA 進(jìn)行了SSR 分子標(biāo)記檢測(cè)與分析,在變異種質(zhì)系基因組中檢出了豐富的變異位點(diǎn).培養(yǎng)基添加法,1998 年顧德峰等[12]將平陽(yáng)霉素添加入小麥幼胚離體培養(yǎng)的培養(yǎng)基中,研究了平陽(yáng)霉素對(duì)小麥幼胚愈傷組織發(fā)生及其植株再生的影響.結(jié)果表明:在20℃下,采用不同質(zhì)量濃度的平陽(yáng)霉素處理幼胚長(zhǎng)度為1.0～1.5 mm 的幼嫩麥粒8 h,然后用蒸餾水洗凈,在超凈工作臺(tái)上用升汞滅菌后剝?nèi)?.0～1.5 mm 的幼胚接種到MS+2,4-D 2mg/L+NAA 0.5mg/L+CH 200mg/L 固體培養(yǎng)基上,形成愈傷組織,愈傷組織在MS+KT 0.2 mg/mL 的培養(yǎng)基上分化出幼苗,10～40μg/mL 的平陽(yáng)霉素可作為對(duì)小麥幼胚外植體離體培養(yǎng)時(shí)的適宜誘變濃度.穗莖注射法,1999 年孫德全等[13]研究了在小麥開(kāi)花期將不同質(zhì)量濃度的平陽(yáng)霉素溶液通過(guò)穗莖注入小麥“龍輻麥3 號(hào)”體內(nèi)的誘變方法.結(jié)果表明:“龍輻麥3 號(hào)”在株高、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、主穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量等方面發(fā)生變異,M1代隨平陽(yáng)霉素質(zhì)量濃度的提高生理?yè)p傷加大,100μg/mL的平陽(yáng)霉素處理M2代變異率較大.葉脈注射法,2002 年張秋英等[14]在小麥孕穗初期對(duì)“晉麥2148”“福繁17”和“綿陽(yáng)35”進(jìn)行葉脈注射平陽(yáng)霉素溶液的誘變研究.結(jié)果表明:在3 個(gè)品種的M2代均出現(xiàn)了明顯的矮稈、熟期、籽粒顏色等性狀變異;這些變異在不同遺傳背景的品種處理中出現(xiàn)的類(lèi)型不同,頻率也有差異;經(jīng)M2代選擇后,在M3代絕大多數(shù)變異株系的穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量等變異性狀已能穩(wěn)定遺傳,而有部分株系的株高和熟期兩個(gè)變異性狀仍在分離.分蘗節(jié)（生長(zhǎng)點(diǎn)）注射法,2011 年張希太等[15]在小麥苗起身后拔節(jié)之前將0~50μg/mL 不同質(zhì)量濃度的鹽酸平陽(yáng)霉素溶液通過(guò)葉鞘注射到小麥品種“蘭考矮早8”的生長(zhǎng)點(diǎn)（分蘗節(jié)）部位,對(duì)平陽(yáng)霉素的誘變效果進(jìn)行了研究.其后代在株高、蠟質(zhì)層、芒型、穗型、葉綠素、生育期等幾個(gè)方面發(fā)生大量變異,通過(guò)對(duì)變異后代的系統(tǒng)選擇得到了pyms-6、pyms-2 兩個(gè)種質(zhì)系.通過(guò)對(duì)“蘭考矮早8”及兩個(gè)種質(zhì)系pyms-6、pyms-2 基因組DNA 的SSR 分子標(biāo)記檢測(cè),在變異種質(zhì)系基因組中檢出了豐富的突變位點(diǎn).

平陽(yáng)霉素用于誘變育種已多有報(bào)道,然而未見(jiàn)博萊霉素應(yīng)有于誘變育種的研究.本研究進(jìn)行了“小麥種子在不同質(zhì)量濃度的博萊霉素溶液中萌發(fā)生長(zhǎng)”的誘變方法,對(duì)“濟(jì)麥22”種子進(jìn)行誘變處理,直至對(duì)照處理培養(yǎng)皿苗長(zhǎng)成2 葉幼苗止.每天利用不同質(zhì)量濃度的博萊霉素溶液進(jìn)行誘變研究,旨在探討博萊霉素對(duì)小麥?zhǔn)欠裼姓T變效應(yīng)及合適的誘變劑量和誘變方法.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

誘變的母體材料為“濟(jì)麥22”種子,取自于邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究室的育種試驗(yàn)材料圃;誘變用的博萊霉素試劑從賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司購(gòu)買(mǎi).

1.2 誘變方法

1.2.1 誘變適期 為了使誘變后的培養(yǎng)皿苗盡快在試驗(yàn)田中移栽,誘變時(shí)期一般選在秋季小麥大田播種前一個(gè)月（9 月份）進(jìn)行.

1.2.2 博萊霉素的處理質(zhì)量濃度 用無(wú)菌自來(lái)水配制0 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL、100 mg/mL 不同質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液.

1.2.3 誘變材料的準(zhǔn)備 選取籽粒飽滿、完整、健康無(wú)病害的“濟(jì)麥22”種子,先用自來(lái)水沖洗去表面的灰塵,然后浸入1 mg/mL 質(zhì)量濃度的升汞（HgCl2）溶液滅菌8~10 min,用無(wú)菌水反復(fù)沖洗滅菌后的種子5~6次備用;將21 套培養(yǎng)皿用無(wú)離子水煮沸滅菌后備用,分別在培養(yǎng)皿中均勻放入滅菌后的“濟(jì)麥22”種子100 粒.

1.2.4 博萊霉素的處理方法 每天上午8:00 在培養(yǎng)皿中加入不同質(zhì)量濃度的博萊霉素溶液5 mL,至液面埋沒(méi)種子的一半為宜,每個(gè)博萊霉素質(zhì)量濃度處理重復(fù)3 次.從第二天起每天上午8:00 觀察培養(yǎng)皿中的博來(lái)霉素溶液量,如發(fā)現(xiàn)溶液量減少及時(shí)補(bǔ)足相應(yīng)質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液;種子萌發(fā)長(zhǎng)成的幼苗頂培養(yǎng)皿蓋時(shí),去掉該處理的培養(yǎng)皿蓋.為防止去掉蓋后培養(yǎng)皿中的水分過(guò)度蒸發(fā)造成博來(lái)霉素溶液質(zhì)量濃度出現(xiàn)偏差,將去蓋后的培養(yǎng)皿移入玻璃罩室內(nèi)培養(yǎng)或用相應(yīng)規(guī)格的燒杯罩住培養(yǎng),對(duì)于去掉蓋的處理每天除上午8:00 觀察是否需要補(bǔ)充相應(yīng)質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液外,其他時(shí)間應(yīng)多次觀察培養(yǎng)皿中的博來(lái)霉素溶液，若發(fā)現(xiàn)因蒸發(fā)導(dǎo)致溶液量減少及時(shí)用無(wú)菌水補(bǔ)足.

1.2.5 調(diào)查項(xiàng)目 調(diào)查各處理的始發(fā)芽時(shí)間、每天的發(fā)芽率、成苗率、苗情等指標(biāo),至0 mg/mL 質(zhì)量濃度處理的麥苗長(zhǎng)成2 葉期時(shí)止.

1.3 大田種植與后代變異情況統(tǒng)計(jì)

1.3.1 M0代的移栽方法 各博萊霉素質(zhì)量濃度處理的培養(yǎng)皿苗為M0代（誘變零代）.誘變結(jié)束后,如果已到了冬小麥的播種季節(jié)（10 月10 日左右）,即可將M0代培養(yǎng)皿苗直接按處理移栽入試驗(yàn)田中,移栽后及時(shí)澆水保證成活;如果還未到冬小麥的播種季節(jié),也可將M0代培養(yǎng)皿苗按博萊霉素質(zhì)量濃度處理先移栽入營(yíng)養(yǎng)缽中,放在陰涼處保存,到冬小麥播種季節(jié)后再移栽入試驗(yàn)田中.

1.3.2 M0代麥苗大田移栽成活率與生長(zhǎng)情況調(diào)查 在M0代的整個(gè)生育期,除調(diào)查移栽成活率外還調(diào)查各博萊霉素質(zhì)量濃度處理植株的生長(zhǎng)異常情況,包括M0代麥苗植株生長(zhǎng)異常類(lèi)型、異常株率等.

1.3.3 M0代的收獲與M1代的播種 第二年小麥成熟后,按不同的博萊霉素質(zhì)量濃度處理收獲并脫粒保存M0代種子;當(dāng)年秋季冬小麥播種時(shí),將各博萊霉素質(zhì)量濃度處理的M0種子單穴單粒播種形成M1代群體,每處理播種不少于3 000 株.并以同樣的方法播種對(duì)照種子.

1.3.4 M1代群體的變異情況統(tǒng)計(jì) 從M1代群體植株出苗到小麥成熟,整個(gè)生育期調(diào)查統(tǒng)計(jì)各博萊霉素質(zhì)量濃度處理出現(xiàn)的變異性狀類(lèi)型、數(shù)量及變異率等.

2 結(jié)果與分析

2.1 各博萊霉素質(zhì)量濃度處理培養(yǎng)皿種子的發(fā)芽生長(zhǎng)情況

各博萊霉素質(zhì)量濃度處理種子的發(fā)芽及生長(zhǎng)情況見(jiàn)表1.

表1 各博萊霉素質(zhì)量濃度處理種子的發(fā)芽及生長(zhǎng)情況Tab.1 Germination and growth of seeds treated with Bleomycin in each concentrations

由表1 可以看出,隨著博來(lái)霉素處理質(zhì)量濃度的提高,“濟(jì)麥22”種子的發(fā)芽時(shí)間推遲,發(fā)芽率降低.當(dāng)博來(lái)霉素處理質(zhì)量濃度為100 mg/mL 時(shí)“濟(jì)麥22”種子不能萌發(fā),僅有部分種子的種胚膨大脹破種皮,隨后在種皮的破裂處形成類(lèi)似愈傷組織的塊狀物.低質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液對(duì)“濟(jì)麥22”種子的發(fā)芽抑制作用較小,1 mg/mL 的博來(lái)霉素溶液僅使“濟(jì)麥22”種子的發(fā)芽速度略微減慢,最終發(fā)芽率仍為100%,質(zhì)量濃度為5 mg/mL、10 mg/mL 的博來(lái)霉素溶液使“濟(jì)麥22”種子的發(fā)芽速度進(jìn)一步減慢,最終發(fā)芽率為97.67%、95.33%,對(duì)發(fā)芽率的影響較小.高質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液對(duì)萌發(fā)后的小麥幼苗的生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用, 10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 的博來(lái)霉素溶液處理的“濟(jì)麥22”種子,在12 d 時(shí)同時(shí)達(dá)到了最大發(fā)芽率,但到15 d 時(shí)都未能長(zhǎng)成二葉期幼苗,幼苗的平均株高僅為4.5 cm、3.1 cm、2.2 cm 都低于對(duì)照株高4.6 cm.較低質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液對(duì)萌發(fā)后的小麥幼苗的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用,1 mg/mL、5 mg/mL 的博來(lái)霉素溶液處理的“濟(jì)麥22”種子雖然達(dá)到最高發(fā)芽率的時(shí)間較對(duì)照晚,但是15 d時(shí)的幼苗高度為5.3 cm、6.7 cm都高于對(duì)照,其中質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的博來(lái)霉素溶液對(duì)種子萌發(fā)后的幼苗促進(jìn)生長(zhǎng)作用最強(qiáng).

2.2 博來(lái)霉素誘變處理M0 代麥苗的大田移栽成活及生長(zhǎng)情況

各博來(lái)霉素質(zhì)量濃度誘變處理M0代麥苗移栽成活率及生長(zhǎng)異常株率見(jiàn)表2.

表2 各博來(lái)霉素溶液質(zhì)量濃度誘變處理M0 代麥苗移栽成活率及生長(zhǎng)異常株率Tab.2 The survival rate and abnormal growth rate of M0 generation wheat seedlings treated by various Bleomycin concentrations

由表2 可以看出,高質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液誘變小麥種子,對(duì)M0代麥苗都有一定生理?yè)p傷,具體表現(xiàn)為:部分小麥植株生長(zhǎng)畸形,葉片扭曲,抽穗畸形等;部分小麥植株生長(zhǎng)停止,不能拔節(jié),不能抽穗,形成小老苗;部分小麥植株出現(xiàn)花葉;還有部分M0代苗出現(xiàn)白化、黃化而死亡.本試驗(yàn)用質(zhì)量濃度為1 mg/mL、5 mg/mL 的博來(lái)霉素質(zhì)量溶液處理的M0代苗中未發(fā)現(xiàn)因生理?yè)p傷而造成的植株生長(zhǎng)異常;用質(zhì)量濃度為10 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mL 的博來(lái)霉素溶液處理的M0代苗中都不同程度的出現(xiàn)了因生理?yè)p傷而造成的生長(zhǎng)異常植株.隨著博來(lái)霉素溶液質(zhì)量濃度的提高M(jìn)0代植株的生理?yè)p傷加重,生長(zhǎng)異常植株率也提高,極端異常植株（小老苗、白化株、黃化株）也出現(xiàn).

博來(lái)霉素誘變處理的M0代植株都是由正常的原母體細(xì)胞和發(fā)生各種基因突變細(xì)胞形成的嵌合體.當(dāng)博來(lái)霉素質(zhì)量濃度較低時(shí)發(fā)生基因突變細(xì)胞占比低,植株的生長(zhǎng)表現(xiàn)由占絕大多數(shù)正常的原母體細(xì)胞決定,所以未明顯表現(xiàn)出生長(zhǎng)異常;當(dāng)博來(lái)霉素質(zhì)量濃度較高時(shí)發(fā)生各種基因突變的細(xì)胞占比高,且隨著博來(lái)霉素質(zhì)量濃度的提高發(fā)生基因突變細(xì)胞占比也提高,因此M0代植株在生長(zhǎng)過(guò)程中出現(xiàn)生長(zhǎng)異常的幾率增加.

2.3 博來(lái)霉素誘變處理M1 代變異類(lèi)型及變異率的統(tǒng)計(jì)

各博來(lái)霉素誘變各處理M1代變異類(lèi)型及變異率的統(tǒng)計(jì)表見(jiàn)表3.

由表3 可以看出,不同質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液誘變處理“濟(jì)麥22”種子,在M1 代中均能產(chǎn)生可遺傳的變異,隨著博來(lái)霉素質(zhì)量濃度的提高性狀變異類(lèi)型越豐富,變異頻率也越高.本試驗(yàn)采用25 mg/mL博來(lái)霉素質(zhì)量濃度誘變處理的“濟(jì)麥22”種子接近半致死劑量,M1代群體中性狀變異類(lèi)型豐富,有益變異頻率較高,因此,在采用“小麥種子在博來(lái)霉素溶液中萌發(fā)生長(zhǎng)”的誘變方法進(jìn)行誘變時(shí),宜采用的博來(lái)霉素溶液質(zhì)量濃度為25 mg/mL.

表3 各博來(lái)霉素誘變各處理M1 代變異類(lèi)型及變異率的統(tǒng)計(jì)表Tab.3 Statistical table of variation type and variation rate of M1generation treated with Bleomycin concentration mutation

3 結(jié)論與討論

本研究證實(shí)了博來(lái)霉素對(duì)小麥具有誘變效應(yīng),能夠誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生可遺傳的變異.M1代群體田間變異類(lèi)型及變異率調(diào)查數(shù)據(jù)表明,博來(lái)霉素質(zhì)量濃度的提高,M1代性狀變異類(lèi)型豐富,變異頻率也越高.這是因?yàn)樵贛0代小麥胚細(xì)胞的分裂DNA 復(fù)制合成過(guò)程中,博來(lái)霉素與鐵的復(fù)合物嵌入小麥胚細(xì)胞DNA,引起DNA 單鏈和雙鏈斷裂，在小麥細(xì)胞DNA 自我修復(fù)的過(guò)程中發(fā)生基因突變?cè)斐傻?

本試驗(yàn)采用的“小麥種子在博來(lái)霉素溶液中萌發(fā)生長(zhǎng)”的誘變方法切實(shí)可行.與文獻(xiàn)[7-15]平陽(yáng)霉素誘變小麥的各種方法相比,本誘變方法對(duì)M0代細(xì)胞誘變時(shí)間長(zhǎng),M0代細(xì)胞被誘變的代數(shù)多,在M0代這種由基因突變細(xì)胞和正常細(xì)胞構(gòu)成的嵌合體中基因突變細(xì)胞所占的比例較大,基因突變細(xì)胞形成生殖細(xì)胞將突變基因遺傳給M1代個(gè)體的幾率也大.

采用“小麥種子在博來(lái)霉素溶液中萌發(fā)生長(zhǎng)”的誘變方法進(jìn)行誘變時(shí),宜采用博來(lái)霉素溶液質(zhì)量濃度為25 mg/mL.此時(shí)“濟(jì)麥22”種子的成苗率為53.33%,接近化學(xué)誘變的半致死劑量.小麥種子和幼苗對(duì)博來(lái)霉素的耐受力強(qiáng),本試驗(yàn)“濟(jì)麥22”種子能夠在50 mg/mL 質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液中萌發(fā),幼苗還能夠在50 mg/mL 質(zhì)量濃度的博來(lái)霉素溶液中長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng);總結(jié)現(xiàn)有文獻(xiàn)[7-15],在應(yīng)用平陽(yáng)霉素誘變小麥時(shí)一般使用的質(zhì)量濃度都在微克每毫升級(jí)別，誘變時(shí)間也只有短短幾個(gè)小時(shí)，說(shuō)明平陽(yáng)霉素對(duì)小麥的生理?yè)p傷較大,分析其原因可能是平陽(yáng)霉素中所含有的博來(lái)霉素以外的抗生素成分對(duì)小麥的生理?yè)p傷大,致使不能使用高劑量的平陽(yáng)霉素對(duì)小麥進(jìn)行化學(xué)誘變.

博來(lái)霉素和平陽(yáng)霉素是類(lèi)似藥物[2-3],二者都應(yīng)用于臨床,通過(guò)干擾抑制腫瘤細(xì)胞DNA 合成來(lái)阻止癌細(xì)胞的增殖,它們這種干擾抑制細(xì)胞DNA 合成的特性還能應(yīng)用于植物的化學(xué)誘變.利用博萊霉素進(jìn)行化學(xué)誘變創(chuàng)制小麥新種質(zhì)資源和新品種培育是一條高效途徑,博來(lái)霉素誘變和常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合可以拓寬基因變異范圍,加速育種進(jìn)程,提高育種效率.