高效液相色譜法測定延齡草中4種甾體皂苷的油水分配系數(shù)及平衡溶解度

左月明，陳林林，張忠立（江西中醫(yī)藥大學，南昌 330004）

延齡草為百合科植物延齡草（Trillium tschonoskiiMaxim.）的根及根莖，俗稱“地珠”，味甘、性平，有小毒，具有鎮(zhèn)靜止痛、活血止血之功效，主治頭暈目眩、跌打損傷、神經衰弱、腦震蕩后遺癥等疾病，是恩施土家族著名的民間藥[1]。延齡草的主要活性成分為甾體皂苷，以4種甾體皂苷偏諾皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（簡稱Y1T）、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →2）-β-D-吡喃葡萄糖苷（簡稱Y2T）、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →4）-[α-L-吡喃鼠李糖基（1 →2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷（簡稱Y3T）、偏諾皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →4）-α-L-吡喃鼠李糖基（1 →4）-[α-L-吡喃鼠李糖基（1 →2）]-β-D-吡喃葡萄糖苷（簡稱Y4T）為主?，F(xiàn)代藥理研究表明，甾體皂苷類成分具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎及防治心腦血管疾病等作用[2-4]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，延齡草中4 種甾體皂苷對心腦血管缺血性疾病具有較強的生物活性，說明此類皂苷具有成藥性的可能。由于這4 種甾體皂苷的平衡溶解度和油水分配系數(shù)未見相關報道，本文對4 種甾體皂苷在不同溶劑中的平衡溶解度以及在不同pH 緩沖液中的油水分配系數(shù)進行測定，旨在預測其體內吸收狀況，為后續(xù)制劑及新藥研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters2695 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；HY-5A 振蕩器（上海力辰邦西科技有限公司）；CP225D 十萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-700DE 超聲清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；NP-30S 渦旋混合器（常州恩培儀器制造有限公司）；TGL-16C 離心機（天津廣豐科技有限公司）；CT-6023 pH 計（杭州艾普儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 對照品（實驗室自制，純度均大于98.0%）。乙腈、甲醇（色譜純，德國默克公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、正辛醇、甲醇、磷酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液配制

2.1.1 不同pH 的緩沖液 按2020年版《中國藥典》四部通則8004 項下方法[5]，配制不同pH 值的磷酸鹽緩沖液，使各緩沖液pH 值分別為2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、7.8。用pH 計檢測各緩沖液的pH 值，并進行校正。

2.1.2 正辛醇水飽和溶液的制備 吸取正辛醇溶液適量，分別與同體積水混合置于500 mL 帶塞的錐形瓶中，室溫下于恒溫振蕩器上振蕩24 h，離心，分取上層和下層，即得水飽和正辛醇、正辛醇飽和水溶液，備用[6]。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取5.00 mg Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 對照品， 分別置于5 mL 量瓶中，加甲醇超聲溶解5 min，定容，搖勻，即得質量濃度均為1.00 mg·mL-1的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（45∶55）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，延齡草4 種甾體皂苷Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 的保留時間分別為11.94、6.58、5.39、4.96 min，結果見圖1。

圖1 4種甾體皂苷對照品的色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of 4 steroidal saponins reference substance

2.3 4 種甾體皂苷含量測定的方法學考察

2.3.1 標準曲線的繪制 精密量取“2.1.3”項下各對照品溶液適量，稀釋得最終質量濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600、0.800、1.000 mg·mL-1的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 系列標準溶液。經0.45 μm 微孔濾膜過濾后，分別進樣測定，記錄峰面積。以藥物質量濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標，峰面積值（Y）為縱坐標，進行線性回歸分析，得回歸方程，結果見表1，Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 在質量濃度0.025 ～1.000 mg·mL-1內與峰面積呈良好的線性關系。

表1 4種甾體皂苷的標準方程及線性范圍 (n ＝8)Tab 1 Standard equation and linearity of 4 steroidal saponins (n＝8)

2.3.2 精密度試驗 取Y1T、Y2T、Y3T、Y4T對照品溶液，連續(xù)測定6 次，結果4 種甾體皂苷RSD值分別為0.32%、0.44%、1.1%、1.7%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 取pH 值7.8 緩沖液（為4 種物質的最大溶解度）的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T水飽和正辛醇溶液6 份，進樣測定其峰面積，計算RSD值分別為3.0%、0.39%、1.5%、1.4%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取Y1T、Y2T、Y3T、Y4T對照品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h，進樣測定其峰面積，根據(jù)其質量濃度計算出RSD值分別為2.3%、2.2%、2.3%、2.0%，表明4 種對照品溶液于室溫下放置24 h 穩(wěn)定。

2.4 4 種甾體皂苷平衡溶解度的測定

2.4.1 在不同介質中的平衡溶解度 分別取過量的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T，置2 mL 具塞離心管中，分別加入1 mL 水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇超聲溶解10 min，使成飽和溶液后，置于25 ℃恒溫振蕩器中，200 r·min-1振蕩8 h，離心（12 000 r·min-1，10 min），各吸取上清飽和液，經適當稀釋后，過0.45 μm 的微孔濾膜，進樣測定，記錄峰面積，結果見表2。

表2 Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 在不同介質中的平衡溶解度(n ＝3)Tab 2 Equilibrium solubility of Y1T，Y2T，Y3T，and Y4T in different solvents (n ＝3)

2.4.2 在不同pH 溶液中的平衡溶解度 分別取過量的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T，置5 mL 具塞離心管中，分別加入3 mL 不同pH 值2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、7.8 的磷酸鹽緩沖液，超聲溶解10 min，使成飽和溶液后，置于25 ℃下恒溫振蕩器中，200 r·min-1振蕩8 h，離心（12 000 r·min-1，10 min），分別吸取上清飽和液，經旋轉蒸發(fā)器適當濃縮后，過0.45 μm 微孔濾膜，進樣測定，記錄峰面積，結果見圖2。

圖2 4種甾體皂苷在不同pH 緩沖液中的平衡溶解度（n ＝3）Fig 2 Equilibrium solubility of 4 steroidal saponins in different pH buffers（n ＝3）

2.5 油水分配系數(shù)的測定

分別取質量濃度為0.5 mg·mL-1的Y1T、Y2T、Y3T、Y4T 水飽和正辛醇溶液1 mL，分別加入pH 值為2.0、3.0、5.0、6.0、7.0、7.8 的磷酸鹽緩沖液1 mL，置于2 mL 具塞離心管中，渦旋混勻30 min，置于25 ℃下恒溫振蕩器中，100 r·min-1振蕩12 h，靜置后，3500 r·min-1離心10 min，小心吸取上層油相，過0.45 μm 的微孔濾膜，精密吸取續(xù)濾液10 μL，進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線分別計算其濃度，并按下式計算表觀油水分配系數(shù)P＝（CV-CwVw）/CwVw，式中P為皂苷的表觀油水分配系數(shù)，C為正辛醇中皂苷的初始濃度，V為水飽和正辛醇的體積（即1 mL），Cw為分配平衡時皂苷在水相中測得的濃度，Vw為水相的體積（即1 mL）。按照公式計算不同pH 磷酸鹽緩沖溶液中表觀正辛醇緩沖溶液分配系數(shù)，結果見表3。

表3 4種甾體皂苷在不同pH 緩沖溶液中的油水分配系數(shù)(n ＝3)Tab 3 Oil-water partition coefficients of 4 steroidal saponins in different pH buffers (n ＝3)

3 討論

3.1 測定介質的選擇

目前關于延齡草中4 種甾體皂苷平衡溶解度測定的相關報道較少，本文結合以往的研究經驗選擇4 種甾體皂苷在5 種常用溶劑介質水、甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇和不同pH 溶液的平衡溶解度進行測定，并對其在不同pH 溶液中的油水分配系數(shù)進行測定，使研究更加系統(tǒng)和全面，可為延齡草中4 種甾體皂苷在藥物制劑方面的研究提供更多參考依據(jù)。

3.2 pH 對4 種甾體皂苷平衡溶解度的測定結果分析

藥物溶解是藥物在體內吸收的前提，故水溶性是藥物吸收的先決條件[7]。若溶解速度大于吸收速度，吸收過程與劑型關系較??；反之，溶解則會成為藥物吸收的限速因素[8-9]。本研究結果顯示：在pH 在2.0 ～7.8 時，4 種甾體皂苷的平衡溶解度總體呈現(xiàn)上升趨勢；當pH 為7.8 時4 種甾體皂苷的平衡溶解度達到最大值分別為46.869、54.054、71.355、63.034 mg·L-1；而當pH 在5 ～6時，4 種甾體皂苷的平衡溶解度出現(xiàn)較低值。結果說明4 種甾體皂苷水溶性均較差，其中Y3T 和Y4T 的水溶性略大于Y1T 和Y2T，后續(xù)的劑型設計中可考慮加入輔料改善其水溶性，增加溶出度，進而提高其生物利用度。

3.3 pH 對4 種甾體皂苷油水分配系數(shù)的測定結果分析

藥物的油水分配系數(shù)用于預測膜的通透性，包括胃腸道吸收、穿過血腦屏障的情況以及與藥動學性質的關系，是藥物成藥性的考察指標之一[10]。由于胃腸道不同位置的pH 不同，如胃1.0 ～3.0，十二指腸4.0 ～6.0，空腸6.0 ～7.0，回腸7.0， 結腸7.8 ～8.0[11]， 因此選擇pH 2.0 ～7.8 的緩沖液作為溶劑。若藥物的logP值在-1 ～2 內，則該藥物脂溶性和水溶性適中，具有較好生物膜滲透性，一般認為在胃腸道有較好吸收的藥物logP＞1[12]。本研究測定了4 種甾體皂苷的油水分配系數(shù)，結果顯示4 種甾體皂苷在水飽和正辛醇-不同pH 磷酸鹽緩沖溶液體系中的logP具有一定的規(guī)律：Y1T 在pH 2.0 ～7.8內的logP值基本趨勢保持不變，這說明Y1T 的logP值對pH 值依賴性不強；Y2T 在pH 3 和6 的緩沖溶液中l(wèi)ogP值為1.345、1.038，說明Y2T 在胃腸道中有較好的吸收，親脂性較好，適合口服給藥；Y3T 在pH 3 的緩沖溶液中l(wèi)ogP值達到最大（為0.884），說明Y3T 脂溶性較Y2T 弱；Y4T在pH 2.0 ～7.8 內logP值隨著pH 的升高而減小，說明隨著pH 的升高其脂溶性減弱，親水性增強，口服吸收利用度下降。

3.4 展望

綜上所述，根據(jù)本試驗對延齡草4 種甾體皂苷的平衡溶解度和油水分配系數(shù)的測定結果可知，機體對延齡草4 種甾體皂苷的吸收性較好，按照生物藥劑學分類系統(tǒng)分類可知，4 種甾體皂苷均屬于低溶解度、高透過性的藥物。所以，研制4 種甾體皂苷口服制劑的關鍵在于增加藥物在體內的溶出度，進而有利于提高其生物利用度，為4 種甾體皂苷的成藥性以及后續(xù)劑型研究奠定基礎。