喀什小檗提取物對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂及炎癥相關(guān)指標(biāo)的影響

艾麗非熱·阿布都外力，阿迪力·阿不都熱合曼，伊木然江·蘇布哈提，阿布來提·阿布力孜，周文婷，艾尼瓦爾·吾買爾（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種常見的慢性心血管系統(tǒng)性疾病，其主要的發(fā)病特點(diǎn)是以動(dòng)脈內(nèi)膜中脂質(zhì)的堆積和炎癥的發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖，進(jìn)而形成泡沫樣細(xì)胞、脂質(zhì)和纖維斑塊，最終引起血管狹窄和血栓形成。隨著人們生活條件的改善和飲食習(xí)慣的改變，AS 已成為最常見的致死因素之一，因此近幾年來人們一直致力于其發(fā)病機(jī)制及治療措施的研究[1-2]。

小檗屬于小檗科植物，世界上約有500 種類型，在中國(guó)約有200 種，主要分布于西部和西南地區(qū)。而新疆小檗的種類主要分為喀什小檗、黑果小檗以及紅葉小檗等[3]?？κ残￠轇erberis kaschgaricaRapr.隸屬小檗科小檗屬，在新疆喀什地區(qū)野生生長(zhǎng)，偶有栽培，其果實(shí)可入藥和食用，具有活血、化瘀、利膽、防治高血壓以及抗炎等作用[4]。本研究探討喀什小檗果實(shí)水提物對(duì)AS 大鼠血脂代謝及炎癥細(xì)胞因子水平的影響，為其進(jìn)一步機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量約200 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）20200004]。給予普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，相對(duì)濕度（50±10）%，溫度（20±2）℃，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前大鼠禁食12 h，不禁水。

1.2 試藥

喀什小檗干燥果實(shí)，采自于新疆喀什，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為小檗科小檗屬喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.的果實(shí)；高脂乳劑（配方：豬油、膽固醇、丙基硫氧嘧啶、吐溫-80、膽酸鈉、丙二醇及蒸餾水）；辛伐他汀片劑（批號(hào)：M018303，杭州默沙東制藥有限公司）；維生素D3注射液（批號(hào)：180905，上海通用藥業(yè)股份有限公司）；總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（批號(hào)分別為：TJYTVSP186、5P9WGDW747、P3X2EB42XH、N16J14RAIK，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；白介素（IL）1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF-α）、IL-10 ELISA 試劑盒（批號(hào)分別為：VEUV2IXI4Y、JAKSHFQB9X、WIUSK3NVUV、ERSH5RSLJC，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.3 儀器

Multiskan Go 型酶標(biāo)儀（美國(guó)Termo Fisher 公司），XPN-100 型低溫超速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），AE-31 顯微鏡（MOTIC 公司）。

2 方法

2.1 AS 模型的建立

將雄性SD 大鼠隨機(jī)分為兩組，分別為空白對(duì)照組（n＝10）與模型組（n＝60），均自由飲水。模型組大鼠灌胃高脂乳劑（10 mL·kg-1），腹腔注射維生素D3（70 U·kg-1），每日1 次，連續(xù)3 d，正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料，造模周期為8周。第9 周，模型組組挑選1 只大鼠，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉對(duì)其進(jìn)行麻醉，對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察，AS 模型的建立以血管內(nèi)形成明顯的斑塊為準(zhǔn)。

2.2 分組與給藥

AS 模型建立成功后，開始給各組大鼠灌胃給藥。將模型組50 只大鼠隨機(jī)分為5 組，每組10 只，即模型對(duì)照組、辛伐他汀陽性對(duì)照組[5 mg/（kg·d）]、喀什小檗提取物低劑量組[60 mg/（kg·d）]、喀什小檗提取物中劑量組[120 mg/（kg·d）]和喀什小檗提取物高劑量組[240 mg/（kg·d）]。10 只健康小鼠作為正常對(duì)照組。給正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃等體積生理鹽水，每日1 次，連續(xù)給藥6 周，記錄各組大鼠體質(zhì)量變化。

2.3 標(biāo)本采集與處理

各組大鼠禁食12 h，對(duì)其進(jìn)行麻醉后處死（3%戊巴比妥鈉），主動(dòng)脈采血，4000 r·min-1離心15 min，收集血清，并進(jìn)行檢測(cè)。分離主動(dòng)脈組織，將組織在4%多聚甲醛中固定24 h，脫水、包埋并制成切片，隨后進(jìn)行蘇木紅-伊紅（HE）染色實(shí)驗(yàn)。

2.4 檢測(cè)大鼠血脂水平

使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 及HDL-C 的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5 血清IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-10 水平檢測(cè)

使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10等炎性因子的含量并記錄數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS 26.0 版）進(jìn)行單因素方差分析處理，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的表達(dá)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠胸主動(dòng)脈組織病理變化

正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰并完整，無脂質(zhì)堆積和斑塊，中膜區(qū)域可發(fā)現(xiàn)很典型的梭形排列的平滑肌細(xì)胞，外膜為疏散的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)；模型對(duì)照組大鼠的主動(dòng)脈組織中內(nèi)膜的增厚極為嚴(yán)重，可見結(jié)構(gòu)不完整的內(nèi)皮細(xì)胞脫落，中膜可見炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，泡沫細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集，并伴有斑塊形成；與模型對(duì)照組相比，辛伐他汀組和喀什小檗水提物低、中、高劑量組大鼠主動(dòng)脈組織的內(nèi)膜增厚程度較輕，內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整并清晰，中膜內(nèi)炎癥細(xì)胞和泡沫樣細(xì)胞浸潤(rùn)較少見，見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理圖（HE，×200）Fig 1 Histopathological characteristics of thoracic aorta among the rats（HE，×200）

3.2 各組大鼠血脂水平的比較

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 的含量升高，HDL-C 的含量降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比，辛伐他汀組、喀什小檗水提物中、高劑量組大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 的含量降低，HDL-C 的含量升高（P＜0.01）；喀什小檗水提物低劑量組大鼠血清中TC 和TG 的含量降低，HDL-C 的含量升高（P＜0.05，P＜0.01），LDL-C 的含量降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清血脂水平比較(n ＝10)Tab 1 Serum lipid levels among the rats (n ＝10)

3.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α 和IL-10水平變化

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量升高，IL-10 的含量降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組相比較，辛伐他汀組、喀什小檗水提物中、高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量降低，IL-10 的含量升高（P＜0.05，P＜0.01），喀什小檗水提物低劑量組血清中IL-1β的含量降低（P＜0.01），喀什小檗水提物低劑量組大鼠血清中IL-6 和TNF-α的含量降低，喀什小檗水提物低、中劑量組大鼠血清中IL-10 的含量升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平比較 (n ＝10)Tab 2 Serum levels of IL-1β，IL-6，IL-10 and TNF-α among the rats (n ＝10)

4 討論

AS 最主要的特點(diǎn)是血脂代謝紊亂并發(fā)炎癥[5-6]。大多數(shù)研究表明[7]，脂代謝紊亂與AS 的形成有密切的關(guān)系，高脂血癥是AS 產(chǎn)生的重要因素，可引起內(nèi)皮血管炎癥，進(jìn)而促進(jìn)沉積在血管內(nèi)膜的LDL-C 氧化修飾成 ox-LDL，形成泡沫樣細(xì)胞，促進(jìn)血管壁脂質(zhì)的堆積以及斑塊和血栓的形成[8]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)AS 大鼠模型，結(jié)果表明，喀什小檗果實(shí)水提物可降低血清中TC、TG 及LDL-C 水平，升高HDL-C 水平，有效改善血脂的紊亂。

炎癥在AS 發(fā)生發(fā)展過程中起著必不可少的作用，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在AS 發(fā)生早期導(dǎo)致內(nèi)皮功能的損傷，接著促進(jìn)斑塊的形成[9]。從國(guó)內(nèi)外眾多動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn)，促炎細(xì)胞因子的水平增高可誘導(dǎo)AS 的發(fā)生，這會(huì)導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子水平的降低[10-11]。IL-1β是一種典型的促炎細(xì)胞因子，也是眾多細(xì)胞因子的中樞，它不僅促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M2 向M1 極化[12]，還可以刺激細(xì)胞間黏附分子的釋放，從而促進(jìn)白細(xì)胞遷移[13]。IL-1β除了自身的促炎能力以外，還可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分泌IL-6，進(jìn)一步加快炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。在炎癥和損傷發(fā)生的早期階段，IL-6表達(dá)量體現(xiàn)了炎癥程度的水平，它由巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞釋放[15]。AS 斑塊不穩(wěn)定的主要原因可能是跟TNF-α和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）水平的增高，進(jìn)而促進(jìn)斑塊中IL-6 的高表達(dá)有關(guān)[16]。TNF-α也是一種炎性細(xì)胞因子，可以促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展，它可能由AS 斑塊中的平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌。有研究發(fā)現(xiàn)，在晚期AS 和急性中風(fēng)的患者體內(nèi)的循環(huán)TNF-α水平高表達(dá)，敲除TNF-α基因的小鼠中斑塊的面積會(huì)減少[17-18]。IL-10 由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分泌產(chǎn)生，AS 發(fā)生的過程中促炎性細(xì)胞因子和趨化因子會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，而IL-10 會(huì)抑制它們的過高表達(dá)，從而促進(jìn)LDL 被巨噬細(xì)胞吞噬，并抑制其釋放MMPs，進(jìn)一步促進(jìn)M2 型轉(zhuǎn)變過程[19-21]。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，喀什小檗果實(shí)水提物具有調(diào)節(jié)血脂代謝、降低炎癥因子的表達(dá)及抑制血管斑塊形成等作用，可有效預(yù)防和抑制AS 的形成。目前，喀什小檗對(duì)AS 的治療作用仍處于初步的探索階段，其作用機(jī)制尚需更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。