艾麗非熱·阿布都外力,阿迪力·阿不都熱合曼,伊木然江·蘇布哈提,阿布來提·阿布力孜,周文婷,艾尼瓦爾·吾買爾(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,烏魯木齊 830011)
動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種常見的慢性心血管系統(tǒng)性疾病,其主要的發(fā)病特點(diǎn)是以動(dòng)脈內(nèi)膜中脂質(zhì)的堆積和炎癥的發(fā)生、內(nèi)皮細(xì)胞的損傷、血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖,進(jìn)而形成泡沫樣細(xì)胞、脂質(zhì)和纖維斑塊,最終引起血管狹窄和血栓形成。隨著人們生活條件的改善和飲食習(xí)慣的改變,AS 已成為最常見的致死因素之一,因此近幾年來人們一直致力于其發(fā)病機(jī)制及治療措施的研究[1-2]。
小檗屬于小檗科植物,世界上約有500 種類型,在中國(guó)約有200 種,主要分布于西部和西南地區(qū)。而新疆小檗的種類主要分為喀什小檗、黑果小檗以及紅葉小檗等[3]??κ残¢轇erberis kaschgaricaRapr.隸屬小檗科小檗屬,在新疆喀什地區(qū)野生生長(zhǎng),偶有栽培,其果實(shí)可入藥和食用,具有活血、化瘀、利膽、防治高血壓以及抗炎等作用[4]。本研究探討喀什小檗果實(shí)水提物對(duì)AS 大鼠血脂代謝及炎癥細(xì)胞因子水平的影響,為其進(jìn)一步機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。
SPF 級(jí)雄性SD 大鼠,體質(zhì)量約200 g,由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(新)20200004]。給予普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,相對(duì)濕度(50±10)%,溫度(20±2)℃,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前大鼠禁食12 h,不禁水。
喀什小檗干燥果實(shí),采自于新疆喀什,經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)與生藥學(xué)教研室帕麗達(dá)·阿布力孜教授鑒定為小檗科小檗屬喀什小檗Berberis kaschgaricaRapr.的果實(shí);高脂乳劑(配方:豬油、膽固醇、丙基硫氧嘧啶、吐溫-80、膽酸鈉、丙二醇及蒸餾水);辛伐他汀片劑(批號(hào):M018303,杭州默沙東制藥有限公司);維生素D3注射液(批號(hào):180905,上海通用藥業(yè)股份有限公司);總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒(批號(hào)分別為:TJYTVSP186、5P9WGDW747、P3X2EB42XH、N16J14RAIK,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);白介素(IL)1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-10 ELISA 試劑盒(批號(hào)分別為:VEUV2IXI4Y、JAKSHFQB9X、WIUSK3NVUV、ERSH5RSLJC,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。
Multiskan Go 型酶標(biāo)儀(美國(guó)Termo Fisher 公司),XPN-100 型低溫超速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司),AE-31 顯微鏡(MOTIC 公司)。
將雄性SD 大鼠隨機(jī)分為兩組,分別為空白對(duì)照組(n=10)與模型組(n=60),均自由飲水。模型組大鼠灌胃高脂乳劑(10 mL·kg-1),腹腔注射維生素D3(70 U·kg-1),每日1 次,連續(xù)3 d,正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料,造模周期為8周。第9 周,模型組組挑選1 只大鼠,腹腔注射3%的戊巴比妥鈉對(duì)其進(jìn)行麻醉,對(duì)大鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行病理形態(tài)學(xué)觀察,AS 模型的建立以血管內(nèi)形成明顯的斑塊為準(zhǔn)。
AS 模型建立成功后,開始給各組大鼠灌胃給藥。將模型組50 只大鼠隨機(jī)分為5 組,每組10 只,即模型對(duì)照組、辛伐他汀陽性對(duì)照組[5 mg/(kg·d)]、喀什小檗提取物低劑量組[60 mg/(kg·d)]、喀什小檗提取物中劑量組[120 mg/(kg·d)]和喀什小檗提取物高劑量組[240 mg/(kg·d)]。10 只健康小鼠作為正常對(duì)照組。給正常對(duì)照組和模型對(duì)照組大鼠灌胃等體積生理鹽水,每日1 次,連續(xù)給藥6 周,記錄各組大鼠體質(zhì)量變化。
各組大鼠禁食12 h,對(duì)其進(jìn)行麻醉后處死(3%戊巴比妥鈉),主動(dòng)脈采血,4000 r·min-1離心15 min,收集血清,并進(jìn)行檢測(cè)。分離主動(dòng)脈組織,將組織在4%多聚甲醛中固定24 h,脫水、包埋并制成切片,隨后進(jìn)行蘇木紅-伊紅(HE)染色實(shí)驗(yàn)。
使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C 及HDL-C 的水平,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
使用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-10等炎性因子的含量并記錄數(shù)據(jù),實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SPSS 26.0 版)進(jìn)行單因素方差分析處理,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的表達(dá)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s),以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈組織形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰并完整,無脂質(zhì)堆積和斑塊,中膜區(qū)域可發(fā)現(xiàn)很典型的梭形排列的平滑肌細(xì)胞,外膜為疏散的結(jié)締組織結(jié)構(gòu);模型對(duì)照組大鼠的主動(dòng)脈組織中內(nèi)膜的增厚極為嚴(yán)重,可見結(jié)構(gòu)不完整的內(nèi)皮細(xì)胞脫落,中膜可見炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),泡沫細(xì)胞和單核細(xì)胞聚集,并伴有斑塊形成;與模型對(duì)照組相比,辛伐他汀組和喀什小檗水提物低、中、高劑量組大鼠主動(dòng)脈組織的內(nèi)膜增厚程度較輕,內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)相對(duì)完整并清晰,中膜內(nèi)炎癥細(xì)胞和泡沫樣細(xì)胞浸潤(rùn)較少見,見圖1。
圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理圖(HE,×200)Fig 1 Histopathological characteristics of thoracic aorta among the rats(HE,×200)
與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 的含量升高,HDL-C 的含量降低(P<0.01);與模型對(duì)照組相比,辛伐他汀組、喀什小檗水提物中、高劑量組大鼠血清中TC、TG 和LDL-C 的含量降低,HDL-C 的含量升高(P<0.01);喀什小檗水提物低劑量組大鼠血清中TC 和TG 的含量降低,HDL-C 的含量升高(P<0.05,P<0.01),LDL-C 的含量降低,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。
表1 各組大鼠血清血脂水平比較(n =10)Tab 1 Serum lipid levels among the rats (n =10)
與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量升高,IL-10 的含量降低(P<0.01);與模型對(duì)照組相比較,辛伐他汀組、喀什小檗水提物中、高劑量組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α的含量降低,IL-10 的含量升高(P<0.05,P<0.01),喀什小檗水提物低劑量組血清中IL-1β的含量降低(P<0.01),喀什小檗水提物低劑量組大鼠血清中IL-6 和TNF-α的含量降低,喀什小檗水提物低、中劑量組大鼠血清中IL-10 的含量升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表2。
表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、IL-10 和TNF-α 水平比較 (n =10)Tab 2 Serum levels of IL-1β,IL-6,IL-10 and TNF-α among the rats (n =10)
AS 最主要的特點(diǎn)是血脂代謝紊亂并發(fā)炎癥[5-6]。大多數(shù)研究表明[7],脂代謝紊亂與AS 的形成有密切的關(guān)系,高脂血癥是AS 產(chǎn)生的重要因素,可引起內(nèi)皮血管炎癥,進(jìn)而促進(jìn)沉積在血管內(nèi)膜的LDL-C 氧化修飾成 ox-LDL,形成泡沫樣細(xì)胞,促進(jìn)血管壁脂質(zhì)的堆積以及斑塊和血栓的形成[8]。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)AS 大鼠模型,結(jié)果表明,喀什小檗果實(shí)水提物可降低血清中TC、TG 及LDL-C 水平,升高HDL-C 水平,有效改善血脂的紊亂。
炎癥在AS 發(fā)生發(fā)展過程中起著必不可少的作用,炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在AS 發(fā)生早期導(dǎo)致內(nèi)皮功能的損傷,接著促進(jìn)斑塊的形成[9]。從國(guó)內(nèi)外眾多動(dòng)物和臨床試驗(yàn)中可以發(fā)現(xiàn),促炎細(xì)胞因子的水平增高可誘導(dǎo)AS 的發(fā)生,這會(huì)導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子水平的降低[10-11]。IL-1β是一種典型的促炎細(xì)胞因子,也是眾多細(xì)胞因子的中樞,它不僅促進(jìn)巨噬細(xì)胞從M2 向M1 極化[12],還可以刺激細(xì)胞間黏附分子的釋放,從而促進(jìn)白細(xì)胞遷移[13]。IL-1β除了自身的促炎能力以外,還可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分泌IL-6,進(jìn)一步加快炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。在炎癥和損傷發(fā)生的早期階段,IL-6表達(dá)量體現(xiàn)了炎癥程度的水平,它由巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞釋放[15]。AS 斑塊不穩(wěn)定的主要原因可能是跟TNF-α和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)水平的增高,進(jìn)而促進(jìn)斑塊中IL-6 的高表達(dá)有關(guān)[16]。TNF-α也是一種炎性細(xì)胞因子,可以促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展,它可能由AS 斑塊中的平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞分泌。有研究發(fā)現(xiàn),在晚期AS 和急性中風(fēng)的患者體內(nèi)的循環(huán)TNF-α水平高表達(dá),敲除TNF-α基因的小鼠中斑塊的面積會(huì)減少[17-18]。IL-10 由調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分泌產(chǎn)生,AS 發(fā)生的過程中促炎性細(xì)胞因子和趨化因子會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷,而IL-10 會(huì)抑制它們的過高表達(dá),從而促進(jìn)LDL 被巨噬細(xì)胞吞噬,并抑制其釋放MMPs,進(jìn)一步促進(jìn)M2 型轉(zhuǎn)變過程[19-21]。
綜上所述,本研究結(jié)果表明,喀什小檗果實(shí)水提物具有調(diào)節(jié)血脂代謝、降低炎癥因子的表達(dá)及抑制血管斑塊形成等作用,可有效預(yù)防和抑制AS 的形成。目前,喀什小檗對(duì)AS 的治療作用仍處于初步的探索階段,其作用機(jī)制尚需更多的實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。