緩釋雙氯芬酸鈉的透明質(zhì)酸可溶性微針的制備與表征*

陳可欣，尚少梅

(北京大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，北京 100191)

透皮給藥是一種安全快捷的給藥方式，但傳統(tǒng)透皮給藥方式效率低下。微針作為一種新型透皮給藥的方式，通過(guò)在皮膚中形成微米級(jí)別的通道來(lái)突破皮膚屏障，從而將藥物高效地遞送至體內(nèi)發(fā)揮藥效，大大地提升給藥效率。除此之外，微針還具有無(wú)痛、無(wú)創(chuàng)、方便給藥、減少尖銳醫(yī)療廢物產(chǎn)生等其他給藥方式不具備的優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)功能不同，微針可大致分為5種類(lèi)型，分別是實(shí)心微針、涂層微針、水凝膠微針、空心微針和可溶微針[1]。其中，可溶微針是由可生物降解的水溶性聚合物制作而成的微米長(zhǎng)針陣列，常用于制作微針的可溶性聚合物有聚乙烯醇、右旋糖酐、殼聚糖、海藻酸鈉、聚乳酸、透明質(zhì)酸等[2]。可溶微針與其他幾種微針相比，生物相容性好，藥物的釋放速率也可以通過(guò)改變微針的載體材料而調(diào)節(jié)，是目前研究的熱點(diǎn)[3]。透明質(zhì)酸是人體內(nèi)源性物質(zhì)，具有良好的生物相容性。以透明質(zhì)酸為基質(zhì)制備的微針力學(xué)性能好，可生物降解，成本低廉[4-5]。透明質(zhì)酸中可加入相應(yīng)藥物制備成微針進(jìn)行給藥，但藥物會(huì)釋放過(guò)快，增加給藥次數(shù)，降低患者的順應(yīng)性，難以維持有效的血藥濃度，無(wú)法保證藥物的治療效果?；诖?，筆者應(yīng)用了一種可緩釋藥物的納米材料b-MSNs。

在不同類(lèi)型的納米載藥材料中，b-MSNs因其具有良好的生物相容性以及穩(wěn)定性而受到越來(lái)越多的關(guān)注[6]。它可以調(diào)節(jié)藥物釋放的速度，提高藥物治療的安全性以及高效性。b-MSNs表面易修飾與功能化，其孔中可以有效地裝載各類(lèi)藥物。且b-MSNs可降解，不會(huì)滯留在身體造成免疫反應(yīng)[7]。DS是臨床中常用的一類(lèi)非甾體類(lèi)抗炎藥，可以治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、各種手術(shù)引起的疼痛及各種原因引起的發(fā)熱?？诜﨑S最常見(jiàn)的不良反應(yīng)是胃腸道反應(yīng)[8]。通過(guò)微針遞送雙氯芬酸鈉可以大大減少不良反應(yīng)的發(fā)生。本文中，將DS包封至b-MSNs后，與HA結(jié)合制成可溶微針，探究b-MSNs的表征、生物相容性、藥物緩釋以及微針的制備工藝、表征、力學(xué)性能的參數(shù)，該微針可在保持良好生物相容性以及力學(xué)性能的同時(shí)緩釋藥物，長(zhǎng)時(shí)間維持有效的藥物濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

材料包括：透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA，天津希恩思生化科技有限公司)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium，DS，北京百靈威科技有限公司)、聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)、十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium chloride，CTAC，北京百靈威科技有限公司)、SD大鼠(斯貝福生物技術(shù)有限公司)、PRMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)、Alpha MEM培養(yǎng)基(北京索萊寶科技有限公司)、青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)、特級(jí)胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，北京翱擎生物科技有限公司)、脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS，SIGMA公司)、ELISA試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)、CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)和三乙醇胺(Triethanolamine，TEA，北京百靈威科技有限公司)。

設(shè)備包括：微針模具(蘇州永沁泉智能設(shè)備有限公司)、離心機(jī)(SIGMA公司)、數(shù)字測(cè)力儀(OMEGA公司)、透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，TEM，徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司)、NanoDrop微量分光光度計(jì)和熒光分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 b-MSNs-DS的合成步驟

將120 mL CTAC(25wt%)、0.9 g TEA和180 mL水在60 ℃條件下連續(xù)攪拌1 h。將混合溶液(5 mL TEOS和95 mL環(huán)己烷)緩慢添加到水溶液中，形成水相和有機(jī)相分層的環(huán)境。低速攪拌60 h。通過(guò)高速離心收集水相中含有CTAC的b-MSNs。將其在60 ℃的酸性甲醇溶液中均勻分散1天，以除去CTAC模板，得到b-MSNs[9]。將180 mg b-MSN、30 mg DS、30 mL PBS超聲分散均勻，黑暗條件下攪拌24 h，離心分離可得b-MSNs-DS。

1.3 透明質(zhì)酸微針的制作方法

6 mL去離子水中加入6 mg的b-MSN-DS，超聲分散均勻，配置成b-MSN-DS溶液，稱取2 g HA，分3次加入b-MSN-DS溶液中并使用渦旋震蕩儀進(jìn)行渦旋，靜置于4 ℃冰箱中24 h，得到膠狀的微針針尖溶液。用上述方法將2 g HA加入6 mL去離子水中，得到膠狀的微針基底溶液。取微針針尖溶液置于PDMS微針模具中，以5 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，使微針針尖溶液完全進(jìn)入微針模具的針尖部分，小心刮除微針基底部的微針針尖溶液，將微針基底溶液置入PDMS微針模具中，以5 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，去除溶液中氣泡制備出b-MSN-DS透明質(zhì)酸微針。使用相同的工藝制備含有等量藥物的DS透明質(zhì)酸微針。制備微針的具體工藝如圖1所示。

1.4 試驗(yàn)方法

將微針以5 N的力按壓在數(shù)層封口膜上1 min，計(jì)數(shù)每層封口膜的針孔個(gè)數(shù)。使用數(shù)字測(cè)力儀計(jì)算微針的受力，將微針基底部固定，針尖朝上，逐漸增加力的強(qiáng)度并記錄針尖位移，制作力-位移曲線圖，以評(píng)估微針的機(jī)械強(qiáng)度。使用MC3T3-E1細(xì)胞，通過(guò)CCK-8法測(cè)試b-MSN的生物相容性。將細(xì)胞以30×103個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，使用含有10%胎牛血清的Alpha MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，之后與不同濃度的b-MSN培養(yǎng)1天、3天、5天，最后加入100 μL/孔的CCK-8工作液共同孵育2 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm處記錄吸光度，將所得數(shù)值與控制組進(jìn)行對(duì)比得出細(xì)胞活性，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。將巨噬細(xì)胞以10×103個(gè)/mL的密度鋪于6孔板中，24 h后吸走原有培養(yǎng)基，加入含有5 μg/mL LPS的培養(yǎng)基刺激巨噬細(xì)胞活化，8 h后加入b-MSN、b-MSN-DS、DS，使用ELISA試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟測(cè)試每組的抗炎效果。使用PBS配置0.01～0.05 mg/mL的雙氯芬酸鈉溶液，使用微量分光光度計(jì)測(cè)試DS溶液的吸光度。選取276 nm處的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得到DS溶液的吸收-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。為驗(yàn)證b-MSN-DS透明質(zhì)酸微針的緩釋效果，將制備好的載藥材料與2 mL PBS置于透析袋內(nèi)密封于透析袋中，將透析袋置入98 mL的PBS中，在37 ℃條件下置于搖床中恒溫震蕩，用來(lái)模擬體外藥物釋放。用微量分光光度計(jì)測(cè)定樣品不同時(shí)間點(diǎn)的樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定藥物含量并繪制釋藥曲線。為檢測(cè)b-MSN-DS透明質(zhì)酸微針有無(wú)刺入皮膚，進(jìn)行離體皮膚刺入試驗(yàn)，具體試驗(yàn)步驟為：將大鼠麻醉后，用剃毛器除去背部毛發(fā)，使用外科手術(shù)刀取下大鼠背部完整的全層皮膚。除去多余的皮下組織后用異丙醇擦拭皮膚的真皮側(cè)，去除粘附在皮下的殘留脂肪。隨后，使用PBS反復(fù)清洗皮膚，之后用紗布擦干。將微針以5 N的力按壓在取下的大鼠皮膚上5 min后放置在固定液中進(jìn)行脫水包埋，將包埋好的皮膚組織進(jìn)行切片，切片的厚度為5 μm。將切好的皮膚組織進(jìn)行脫蠟后再進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。

2 結(jié)果與討論

2.1 b-MSN及b-MSN-DS表征

通過(guò)TEM對(duì)b-MSN及b-MSN-DS進(jìn)行了表征，透射電子顯微鏡圖片如圖2所示。圖2a中顯示b-MSN呈均勻的球形，具有有序的介孔結(jié)構(gòu)；圖2b顯示b-MSN負(fù)載DS后，納米粒子的形態(tài)變化不大，這是由于藥物進(jìn)入介孔，沒(méi)有影響b-MSN的球形結(jié)構(gòu)。

2.2 微針表征

所制備的微針陣列為直徑17.5 mm的圓形，每片微針針尖個(gè)數(shù)為358，針尖距離為700 μm，針尖高度為500 μm。微針的表征如圖3所示，圖3a為微距攝像機(jī)下的b-MSN-DS透明質(zhì)酸微針；圖3b為掃描電子顯微鏡下的微針針尖，掃描電子顯微鏡下顯示微針針尖分布均勻；圖3c為掃描電子顯微鏡下的單個(gè)微針針尖，針尖呈錐形。微針的表征顯示微針充分填滿了PDMS微針模具，形成針尖尖銳、分布均勻的微針。

2.3 微針機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試

純透明質(zhì)酸微針和b-MSN透明質(zhì)酸微針的力-位移曲線(見(jiàn)圖4a)變化不大，且刺破前三層封口膜的針尖個(gè)數(shù)一致(見(jiàn)圖4b)，說(shuō)明b-MSN對(duì)微針的機(jī)械強(qiáng)度影響不大。力-位移曲線圖顯示，隨著施加的力逐漸增大，直到單個(gè)針尖受力為0.25 N之前，微針的位移變化不大，說(shuō)明微針針尖未被破壞。該微針針尖個(gè)數(shù)為358，共能承受89.5 N的力。相關(guān)文獻(xiàn)顯示單個(gè)微針針尖刺破皮膚所需的力大于0.058 N即可[10]。所以該微針完全可以刺破皮膚。

2.4 生物相容性試驗(yàn)

透明質(zhì)酸是通過(guò)美國(guó)食品藥監(jiān)局審核的一種安全的材料，有多種臨床用途，可以保水、潤(rùn)滑、促進(jìn)修復(fù)等。DS也是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥物，其用藥量與安全性已經(jīng)過(guò)相關(guān)檢驗(yàn)。所以筆者檢測(cè)了b-MSN的生物相容性(見(jiàn)圖5)，經(jīng)過(guò)CCK-8檢測(cè)，不同濃度梯度的b-MSN與MC3T3-E1細(xì)胞孵育24 h后與未加b-MSN的對(duì)照組相比，細(xì)胞活性均在85%以上，b-MSN與細(xì)胞孵育1天、3天、5天后，細(xì)胞活性也沒(méi)有明顯的下降。說(shuō)明b-MSN材料安全性高，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響。

2.5 抗炎試驗(yàn)

LPS可以刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，如IL-1β、IL-6，導(dǎo)致組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[11]。DS可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6的表達(dá)來(lái)抑制炎癥。將b-MSN、b-MSN-DS、DS和LPS誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞共同孵育，使用ELISA試劑盒測(cè)定每組巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6的多少，每組重復(fù)3次。b-MSN抗炎效果如圖6所示，圖6顯示LPS刺激后，IL-1β、IL-6分泌明顯增加，b-MSN-DS組和DS組有抑制炎癥的效果且b-MSN-DS組效果更明顯，這可能是b-MSN-DS具有緩釋作用使抗炎效果更佳。

2.6 體外藥物釋放試驗(yàn)

經(jīng)計(jì)算b-MSN-DS的載藥率為3.8%。b-MSN-DS透明質(zhì)酸微針釋藥曲線(見(jiàn)圖7)顯示，藥物在10 h內(nèi)快速釋放，隨后進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定的階段，在70 h后藥物釋放量才幾乎沒(méi)有變化。DS透明質(zhì)酸微針在5 h幾乎就釋放完全部的藥物。b-MSN-DS透明質(zhì)酸微針可以達(dá)到緩釋藥物的效果，進(jìn)而提高治療效果，降低給藥頻率。

2.7 離體皮膚刺入試驗(yàn)

皮膚組織縱向切片后進(jìn)行HE染色(見(jiàn)圖8)，顯微鏡下可觀察到皮膚的表皮層、真皮層和皮下組織。以5 N的力刺入皮膚5 min后，刺破角質(zhì)層，形成微通道。藥物可經(jīng)該通道進(jìn)入皮下，發(fā)揮藥效。

3 結(jié)語(yǔ)

本文基于可溶性微針技術(shù)制備了緩釋雙氯芬酸鈉的透明質(zhì)酸可溶性微針，并對(duì)微針內(nèi)部的載藥材料b-MSNs-DS的表征以及微針的制備工藝、表征、生物相容性、抗炎效果、藥物緩釋效果、力學(xué)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。b-MSNs-DS透明質(zhì)酸微針可以緩釋藥物，從而較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持有效的藥物濃度，解決了藥物釋放過(guò)快的問(wèn)題。在臨床醫(yī)學(xué)中有廣泛的應(yīng)用前景。