網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討肺康顆粒對(duì)慢性阻塞性肺疾病大鼠Hippo信號(hào)通路核心分子MST1/2的影響

馮浠鐮，張偉，劉小虹，楊柳柳

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510405）

全球慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）倡議（GOLD）的最新更新將COPD的概念定義為一種常見的、可預(yù)防和可治療的疾病，其特征為持續(xù)性呼吸道癥狀和氣流受限[1 s內(nèi)呼氣量（FEV1）＜80%預(yù)計(jì)值，F(xiàn)EV1/用力肺活量（FVC）＜70%]，通常是由于長(zhǎng)期暴露于有害顆粒或煙霧、引起氣道和/或肺泡異常所致[1-2]。COPD是導(dǎo)致全世界死亡率上升的主要原因，并且在不斷增加[3-5]。COPD西醫(yī)藥物療法主要包括吸入性支氣管擴(kuò)張藥（如β2-激動(dòng)劑、抗膽堿能藥等）和糖皮質(zhì)激素，這些藥物已被證明可有效緩解癥狀并降低加重風(fēng)險(xiǎn)；然而，COPD的治療仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)椋珻OPD患者的癥狀和氣道炎癥會(huì)持續(xù)存在[6-7]，盡管積極地應(yīng)用藥物維持治療，某些患者的病情仍繼續(xù)加重、持續(xù)惡化[8]。

中醫(yī)藥因可靠的治療效果和較少的副作用為系統(tǒng)性預(yù)防和治療COPD等復(fù)雜疾病提供了廣闊的前景[9-11]。肺康顆粒以“培土生金”為成方思想，由五指毛桃、太子參、白術(shù)、炒紫蘇子、茯苓、北杏仁等組成，具有補(bǔ)脾益肺兼以化痰止咳的功效，本課題組前期臨床研究表明，其可有效治療COPD。另外，本課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)的方法，探究了肺康顆粒的治療成方、作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路[12]，發(fā)現(xiàn)肺康顆粒可能通過Toll樣受體4（TLR4）/核因子kappaB（NFκB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干預(yù)炎癥基因的表達(dá)，減輕COPD大鼠的炎癥反應(yīng)[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究再應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測(cè)肺康顆粒治療COPD的關(guān)鍵通路，并構(gòu)建COPD大鼠模型進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，以期為肺康顆粒臨床應(yīng)用治療COPD提供研究基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物取70只12周齡的SPF級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量220~240 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002。實(shí)驗(yàn)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通動(dòng)物房進(jìn)行。

1.2 藥物肺康顆粒由五指毛桃30 g、太子參20 g、白術(shù)15 g、炒紫蘇子10 g、茯苓15 g、北杏仁10 g組成，中藥材來源于康美藥業(yè)。地塞米松注射液（山東辰欣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H37021969）。

1.3 試劑與儀器XMU-MP-1[哺乳動(dòng)物不育系20樣激酶（MST）抑制劑，美國(guó)APExBIO生物科技有限公司]；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝、RNA提取液、Servicebio?RT第一鏈cDNA合成試劑盒、2×SYBR Green qPCR預(yù)混液和引物合成（武漢賽維爾生物科技有限公司）。七匹狼香煙，購(gòu)于福建龍巖煙草工業(yè)有限責(zé)任公司。病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；超微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康公司）。

1.4 分組、造模及給藥將70只大鼠隨機(jī)分為7組，分別為正常組，模型組，肺康顆粒低、中、高劑量組，MST抑制劑組和地塞米松組，每組各10只。除正常組外，其余大鼠采用單純煙熏法構(gòu)建COPD模型[14]。造模方法：使用七匹狼香煙，每次10根，每次煙熏1 h，每天2次，大鼠間隔休息時(shí)間15 min，連續(xù)24周。

肺康顆粒組的大鼠等效劑量按60 kg體質(zhì)量成人給藥劑量（1.617 g/kg生藥量）折算，低、中、高劑量分別等效于臨床擬用劑量的1、2、4倍[13]。從造模第5周開始用藥：肺康顆粒低、中、高劑量組分別給予肺康顆粒10.11、20.22、40.44 g/kg（以生藥量計(jì)）灌胃；地塞米松組給予地塞米松1.0 mg/kg腹腔注射；MST抑制劑組給予XMU-MP-1（5%DMSO溶解）1.0 mg/kg腹腔注射；模型組和正常組給予0.9%生理鹽水2.5 mL灌胃。每天1次，連續(xù)灌胃20周。

1.5 肺康顆粒-COPD交集靶點(diǎn)京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析通過傳統(tǒng)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）獲取中藥成分和靶點(diǎn)，在GeneCards以及OMIM等網(wǎng)站上檢索COPD的相關(guān)靶點(diǎn)，應(yīng)用Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）獲取最新安裝包，通過R語言運(yùn)算得到肺康顆粒成分靶點(diǎn)-COPD交集靶點(diǎn)，將交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析，并導(dǎo)出相關(guān)信號(hào)通路，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 熒光定量PCR法檢測(cè)肺組織TLR4、核因子kappaB抑制蛋白（IκB）、MST1/2、Rac1 mRNA表達(dá)取肺組織用1 mL RNA提取液提取總RNA，用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度。配制如下反應(yīng)體系，2×qPCR Mix 7.5μL、2.5μmol/L基因引物1.5μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μL、ddH2O 4.0μL，進(jìn)行定量PCR。結(jié)果用ΔΔCT法處理。TLR4上游引物序列為5’-GCCATCATTATGAGTGCCAATT-3’，下游引物序列為5’-AGGGATAAGAACGCTGAGAAT T-3’，擴(kuò)增片段為149 bp；IκB上游引物序列為5’-CTTAGTCTTTGGCTACGTCACT-3’，下游引物序列為5’-CTAGGTCATTCTGCAGGTCAAG-3’，擴(kuò)增片段為176 bp；MST1/2上游引物序列為5’-ACCC GTGTCGATATTAAGAGAC-3’，下游引物序列為5’-GCTCATCTTCATCCGAGTTTTC-3’，擴(kuò)增片段為201 bp；Rac1上游引物序列為5’-CCACTGTCC CAATACTCCTATC-3’，下游引物為5’-CTTCTTC TCCTTCAGCTTCTCA-3’，擴(kuò)增片段為159 bp；GAPDH上游引物序列為5’-ACGGGAAGCTCACT GGCATGGCCTT-3’，下游引物為5’-CATGAGGT CCACCACCCTGTTGCTG-3’，擴(kuò)增片段為164 bp。

1.7 蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察肺組織病理形態(tài)將肺組織進(jìn)行石蠟切片并脫蠟：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20 min-二甲苯Ⅱ20 min-無水乙醇Ⅰ5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-75%酒精5 min，自來水洗；蘇木素染色：切片入蘇木素染液染3~5 min，自來水洗，分化液分化，自來水洗，返藍(lán)液返藍(lán)，流水沖洗；伊紅染色：切片依次放入85%、95%的梯度酒精脫水各5 min，放入伊紅染液中染色5 min；脫水封片：切片依次放入無水乙醇I 5 min-無水乙醇Ⅱ5 min-無水乙醇Ⅲ5 min-二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min透明，中性樹膠封片；顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法采用R語言進(jìn)行KEGG通路分析。熒光定量PCR結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用STATA 15.0/C統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組比較采用單因素方差分析，并用GraphPad作圖。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 KEGG通路分析結(jié)果利用R語言運(yùn)算，對(duì)肺康顆粒-COPD交集基因靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，導(dǎo)出相關(guān)信號(hào)通路相關(guān)通路，如表1所示。研究[15]表明，樹突狀細(xì)胞與巨噬細(xì)胞屬于抗原提呈細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞在肺內(nèi)具有清除病原體、參與組織修復(fù)作用，而COPD存在反復(fù)感染風(fēng)險(xiǎn)和肺組織結(jié)構(gòu)的破壞。由于Hippo通路對(duì)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞具有調(diào)控作用，為研究其對(duì)COPD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)情況，故選擇該通路（P＜0.05，靶基因數(shù)目5個(gè)）。

表1 肺康顆粒治療慢性阻塞性肺疾病的KEGG通路分析結(jié)果Table 1 KEGG pathway analysis results on chronic obstructive pulmonary disease treated by Feikang Granules

2.2 各組大鼠肺組織TLR4、IκB、MST1/2、Rac1 mRNA表達(dá)比較圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織TLR4 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組TLR4 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組及MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組和地塞米松組TLR4 mRNA表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，肺康顆粒高劑量組與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠肺組織TLR4、IκB、MST1/2、Rac1 mRNA表達(dá)比較Figure 1 Comparison of mRNA expression of TLR4，IκB，MST1/2 and Rac1 in lung tissues among various groups of rats

與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織IκB mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組大鼠肺組織IκB mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與模型組和MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組和地塞米松組IκB mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中，肺康顆粒高劑量組與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織MST1/2 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組和地塞米松組大鼠肺組織MST1/2 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組和MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組MST1/2 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

與正常組比較，模型組和MST抑制劑組大鼠肺組織Rac1 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，MST抑制劑組大鼠肺組織Rac1 mRNA表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與模型組和MST抑制劑組比較，肺康顆粒低、中、高劑量組Rac1 mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而地塞米松組Rac1 mRNA表達(dá)水平降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

結(jié)果表明，應(yīng)用肺康顆粒及地塞米松后可提升COPD大鼠及使用MST抑制劑的大鼠肺組織下降的TLR4、IκB、MST1/2、Rac1的RNA轉(zhuǎn)錄。

2.3 各組大鼠肺組織病理變化比較圖2結(jié)果顯示，正常組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，炎癥細(xì)胞數(shù)目浸潤(rùn)少，模型組和MST抑制劑組大鼠肺泡壁變薄、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，而肺康顆粒組和地塞米松組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)較模型組和MST抑制劑組有不同程度的恢復(fù)。

圖2 各組大鼠肺組織病理變化比較（HE染色，×400）Figure 2 Comparison of histopathologicalchanges in the lung tissues among various groups of rats（HE staining，×400）

3 討論

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）可歸屬于中醫(yī)學(xué)“肺脹”的范疇。本虛標(biāo)實(shí)是本病的主要病機(jī)，本虛以氣虛為先，而后可發(fā)展為陽虛，標(biāo)實(shí)為痰濁、瘀血。肺康顆粒則適用于氣虛兼有痰濁之證，多應(yīng)用于COPD早期患者。肺康顆粒取培土生金的組方思想，具有益氣健脾、化痰止咳的功效，其中：五指毛桃、太子參補(bǔ)益脾氣以健肺氣，白術(shù)、茯苓健脾除濕以減少生痰之源，紫蘇子、杏仁降逆肺氣以止咳平喘。中藥復(fù)方是一種多組分多靶點(diǎn)的藥物組成，可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)分子網(wǎng)絡(luò)的活性組分來實(shí)現(xiàn)其特定的治療功效。隨著生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)和多元藥理學(xué)的飛速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被證明是探索中藥配伍和機(jī)理的有效方法[9，16]。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分子對(duì)接KEGG富集分析的方法，從理論上導(dǎo)出Hippo信號(hào)通路，并通過實(shí)驗(yàn)觀察肺康顆粒通過Hippo信號(hào)通路核心分子MST1/2對(duì)COPD大鼠的免疫調(diào)節(jié)及組織修復(fù)作用。

Hippo信號(hào)通路最初由Yu、Zhang等[17-18]在果蠅中發(fā)現(xiàn)。哺乳動(dòng)物中典型的Hippo途徑的核心成分由哺乳動(dòng)物STE20樣蛋白激酶MST1/2及其銜接蛋白、Sav家族中含WW域的蛋白（WW45）、Mps的一種結(jié)合劑1A/B（MOB1A/B）、Yes-相關(guān)蛋白（YAP）等組成。MST包括MST1（STK4）、MST2（STK3）、MST3和MST4，屬于生發(fā)中心激酶（GCK）家族，MST1和MST2中78%的氨基酸是同源的[19]。MST1分布于細(xì)胞質(zhì)中，結(jié)構(gòu)高度保守，它是一種由487個(gè)氨基酸組成的絲氨酸和蘇氨酸激酶，分子量約為55.7 kDa，總長(zhǎng)度約113 kb，位于人體細(xì)胞的20q11染色體上[20]。在人類中，MST1包含一個(gè)激酶區(qū)和一個(gè)調(diào)節(jié)區(qū)，調(diào)節(jié)區(qū)位于C端，其包含2個(gè)功能域[21]。MST1/2激活主要通過2個(gè)途徑，一是Caspase介導(dǎo)的裂解可以在C末端切割2個(gè)功能域以激活MST1/2，二是通過自身磷酸化，MST1/2在細(xì)胞凋亡或應(yīng)激刺激下多個(gè)位點(diǎn)被磷酸化，其中，Thr183和Thr187是MST1/2激活所必需的[22]。

Hippo信號(hào)通路對(duì)固有免疫具有調(diào)節(jié)作用。Hippo信號(hào)通路通過區(qū)分自身和非自身成分發(fā)揮固有免疫，而固有免疫系統(tǒng)構(gòu)成了抵抗微生物感染的第一條關(guān)鍵線。吞噬細(xì)胞，如嗜中性粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（DC），可以利用模式識(shí)別受體來檢測(cè)、吞噬，并殺死細(xì)胞外病原體[15]。Hippo信號(hào)通路分子MST1/2在COPD中巨噬細(xì)胞的極化，參與肺組織損傷和修復(fù)，可吞噬清除病原微生物和凋亡細(xì)胞[23-24]?；钚匝跏峭淌杉?xì)胞發(fā)揮吞噬和殺滅作用的主要介質(zhì)，MST1/2通過信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)活性氧產(chǎn)生和細(xì)菌清除[25]。當(dāng)吞噬細(xì)胞MST1/2缺失時(shí)，出現(xiàn)明顯的促炎表型，病原體的吞噬作用降低[19]。

Hippo信號(hào)通路對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答同樣具有調(diào)節(jié)作用。最初的體外研究表明，MST1/RAPL復(fù)合物在T細(xì)胞受體或趨化因子刺激后，對(duì)活化、介導(dǎo)T細(xì)胞的粘附和遷移發(fā)揮重要作用[26]。另外，Zhao等[27]進(jìn)行的體內(nèi)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，功能喪失的MST突變導(dǎo)致Hippo信號(hào)通路組件在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答中受到影響。1項(xiàng)針對(duì)人類聯(lián)合免疫缺陷病兩個(gè)家系的4名患者的研究表明，患者外周血循環(huán)中的幼稚T細(xì)胞數(shù)量顯著減少，T細(xì)胞的體外活力顯著受損，而這些患者帶有MST的突變[19]。因此，Hippo通路的重要調(diào)節(jié)因子激酶MST1/2的免疫調(diào)節(jié)作用意義深遠(yuǎn)。

本研究結(jié)果顯示，COPD大鼠呈MST1/2低表達(dá)狀態(tài)，Hippo信號(hào)通路可能被抑制，故推測(cè)肺組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)能力下降，是肺泡結(jié)構(gòu)破壞中的一個(gè)重要因素。肺康顆粒干預(yù)可提高肺組織MST1/2表達(dá)，通過Hippo信號(hào)通路增強(qiáng)細(xì)胞增殖和存活，增強(qiáng)組織修復(fù)能力，改善細(xì)胞免疫，減輕COPD大鼠肺組織損傷。

本研究同時(shí)測(cè)定了肺組織中TLR4、IκB、Rac1的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果顯示：相對(duì)于MST抑制劑組和模型組，肺康顆粒低、中、高劑量組TLR4、IκB、Rac1的轉(zhuǎn)錄水平均升高（P＜0.05）；在TLR4、IκB轉(zhuǎn)錄情況方面，肺康顆粒高劑量組與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而在Rac1轉(zhuǎn)錄情況方面，肺康顆粒高劑量組較地塞米松組上調(diào)（P＜0.05）；隨著劑量的增加，肺康顆粒低、中、高劑量組TLR4、IκB、Rac1轉(zhuǎn)錄水平逐漸上調(diào)（P＜0.05）。

TLR4是Toll樣受體模式的識(shí)別受體，可檢測(cè)入侵的微生物和非微生物內(nèi)源性分子，由巨噬細(xì)胞表達(dá)[28]，我們推測(cè)肺康顆粒通過Hippo信號(hào)通路調(diào)控免疫時(shí)，增加了TLR4的轉(zhuǎn)錄。IκB是NF-κB信號(hào)通路上的抑制蛋白，NF-κB通路的抑制可降低異常炎癥反應(yīng)，因此，有研究應(yīng)用NF-κB通路的抑制劑來治療哮喘及COPD[29]，而Hippo信號(hào)通路下游的YAP可直接調(diào)節(jié)IκB轉(zhuǎn)錄[30]，故我們推測(cè)肺康顆粒通過增加IκB轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制NF-κB通路來治療COPD。有研究顯示TLR4信號(hào)通過機(jī)械傳感器Piezo1蛋白增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌活性，是因?yàn)榧せ盍司奘杉?xì)胞CaMKII-MST1/2-Rac軸以進(jìn)行病原體攝取和殺死，敲除MST1/2或Rac1會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞殺菌活性降低[31]，故我們推測(cè)肺康顆粒通過促進(jìn)MST1/2和Rac1轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，肺康顆?？赏ㄟ^調(diào)控COPD大鼠肺組織Hippo信號(hào)通路中MST1/2的表達(dá)，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及組織損傷修復(fù)作用。