石斛乙醇提取物對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜血管生成的影響

金昱，呂璐

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眼科，山東濟(jì)南 250011）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy）是糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）[1]的一種特定微型血管并發(fā)癥，以視網(wǎng)膜血管改變?yōu)椴±硖卣鳎饕R床表現(xiàn)為眼底視網(wǎng)膜滲出水腫、新生血管、出血及增殖膜形成等，可導(dǎo)致患者視力下降甚至失明[2]。石斛作為名貴中藥材，性微寒，味甘，歸胃、腎經(jīng)，具有益胃生津，滋陰清熱之功效，可用于目暗不明、陰傷津虧、口干煩渴等癥。石斛的常用制劑方法有水提取和醇提取，可有效提取石斛中極性較大的成分。已有研究顯示，采用乙醇提取的石斛提取物較水提物的抑癌作用高[3]。石斛乙醇提取物也已被證實(shí)有提高機(jī)體自身免疫，抑制血管形成，緩解眼部疲勞，改善糖尿病及炎性癥狀、眼部循環(huán)等作用[4-7]。因此，本研究擬通過構(gòu)建T2DM模型，探討石斛乙醇提取物對(duì)T2DM大鼠視網(wǎng)膜血管生成的作用及機(jī)制，以期為石斛乙醇提取物相關(guān)藥物的研發(fā)和T2DM的臨床治療提供基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取105只8周齡SPF級(jí)雄性健康大鼠，體質(zhì)量為180~220 g，均購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2018-0002。大鼠飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，使用許可證號(hào)：SYXK（魯）2018-0015，環(huán)境：溫度23~25℃，相對(duì)濕度50%~70%，光照晝夜交替循環(huán)12 h/12 h。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物、試劑與儀器 鐵皮石斛（干燥莖），購自山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院藥房；羥苯磺酸鈣（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20030087），南京長(zhǎng)澳制藥有限公司生產(chǎn)。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），北京Solarbio公司；白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒，美國(guó)Abcam公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒，美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗大鼠缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）多抗，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）多抗，美國(guó)Bioworld公司；羊抗兔二抗-辣根過氧化物酶（HRP），美國(guó)Abcam公司。光學(xué)顯微鏡，深圳市諾視奇科技有限公司；電泳儀、垂直電泳槽，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 石斛乙醇提取物的制備參照文獻(xiàn)方法[8]，取鐵皮石斛干燥莖，用10倍量不同濃度的乙醇回流提取，合并提取液后減壓濃縮，經(jīng)濾過、萃取、減壓回收，硅膠柱色譜分離后，采用制備薄層及重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化，得到提取物。

1.4 建模、分組與干預(yù)方法T2DM建模方法[9]：隨機(jī)選取85只大鼠禁食1 d，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，一次性給予尾靜脈注射35 mg·kg-1STZ溶液誘導(dǎo)T2DM模型，送回鼠籠飼養(yǎng)。3 d后血糖儀檢測(cè)血漿空腹血糖（FPG），F(xiàn)PG≥16.7 mmol·L-1即為建模成功。取建模成功的80只大鼠，隨機(jī)分為模型組，石斛提取物低、高劑量組與陽性藥物組，每組20只；余下20只設(shè)為正常組。參照文獻(xiàn)研究[10]用量并根據(jù)黃繼漢等[11]的動(dòng)物與人體間等效劑量換算公式計(jì)算大鼠給藥劑量。石斛提取物低、高劑量組分別給予石斛乙醇提取物100、300 mg·kg-1灌胃，陽性藥物組給予羥苯磺酸鈣5.4 mg·kg-1灌胃，正常組和模型組則給予等體積生理鹽水灌胃。每日1次，持續(xù)12周。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 糖尿病常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 分別在干預(yù)治療后6、12周，各組大鼠禁食1 d，取尾靜脈血，應(yīng)用血糖自動(dòng)檢測(cè)儀、碘（125I）胰島素放射免疫分析試劑盒分別檢測(cè)大鼠血漿FPG、血清空腹胰島素（FINs）含量。

1.5.2 視網(wǎng)膜組織血管變化 末次采血后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，采用熒光素眼底血管造影術(shù)檢查（fluorescein fundus angiography，F(xiàn)FA）法觀察大鼠視網(wǎng)膜組織血管的變化情況。滴入復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳，然后注射90 g·L-1特殊藥物熒光素鈉（1 mg·kg-1），采用血管造影儀觀察大鼠視網(wǎng)膜血管的變化情況。

1.5.3 組織樣品采集 FFA法檢查結(jié)束后，處死各組剩余16只大鼠，取視網(wǎng)膜組織，每組取4只大鼠的視網(wǎng)膜組織，置于4%多聚甲醛固定備用，余下大鼠視網(wǎng)膜組織則置于-80℃冰箱存儲(chǔ)備用。

1.5.4 蘇木素-伊紅染色法觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化 取4%多聚甲醛固定備用視網(wǎng)膜組織，石蠟包埋，切片（厚5μm），加熱脫蠟。蘇木素染色（3~5 min），清洗，切片置于1%（V/V）H2O2中浸泡10~30 s，水洗，伊紅染色（20 min）。脫水，透明，中性樹脂封固，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.5.5 ELISA法測(cè)定視網(wǎng)膜組織炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量 取-80℃存儲(chǔ)備用視網(wǎng)膜組織，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿、離心，取上清液。按IL-6、IL-1β、TNF-αELISA試劑盒說明書步驟操作：抗體包被過夜（4℃）、洗滌，加入待測(cè)抗原和辣根過氧化物酶標(biāo)記抗原（37℃、60 min），加底物液（37℃、20 min），加終止液。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算視網(wǎng)膜組織中IL-6、IL-1β、TNF-α含量。

1.5.6 PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF基因表達(dá) 取-80℃存儲(chǔ)備用視網(wǎng)膜組織研磨，TRIzol法提取總RNA，測(cè)定RNA純度及濃度，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：1μL Taq聚合酶、1μL上下游引物、4μL模板cDNA、18μL ddH2O。擴(kuò)增條件：預(yù)變性（95℃，300 s）、變性（95℃，30 s）、退火（60℃，30 s），共計(jì)40個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線，降溫（50℃，30 s）。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量分析，重復(fù)3次，取Ct均值。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.7 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá) 取-80℃存儲(chǔ)備用視網(wǎng)膜組織，添加RIPA裂解緩沖液，離心，取上清液，以蛋白定量BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，上樣，進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，置于5%脫脂牛奶（25℃，封閉2 h），加入HIF-1α（1∶500稀釋）、VEGF（1∶500稀釋）一抗孵育（4℃，24 h），TBST緩沖液洗膜，再加二抗（1∶1 000稀釋）孵育（25℃，2 h），洗膜，曝光，顯影。以ImageJ軟件測(cè)定HIF-1α、VEGF及β-actin條帶灰度值。目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用目標(biāo)條帶與β-actin條帶灰度比值表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩樣本間進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FPG、FINs值比較表2結(jié)果顯示：干預(yù)后6、12周后FPG、FINs指標(biāo)組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組FPG、FINs值升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組FPG、FINs值降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，石斛提取物低、高劑量組FPG、FINs值升高，但石斛提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）值比較Table 2 Comparison of FPG and FINs values of rats among various groups （±s）

表2 各組大鼠空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINs）值比較Table 2 Comparison of FPG and FINs values of rats among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性藥物組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數(shù)/只20 20 20 20 20 FPG/（mmol·L-1）干預(yù)6周4.76±0.61 17.82±0.97①16.35±0.92①②③12.28±0.85①②11.91±0.78①②740.281＜0.001干預(yù)12周4.64±0.62 17.35±0.94①15.56±0.90①②③11.41±0.52①②11.12±0.67①②863.216＜0.001 FINs/（μU·L-1）干預(yù)6周19.65±1.70 28.84±1.59①24.48±1.17①②③21.37±1.68①②20.98±1.57①②112.295＜0.001干預(yù)12周19.07±1.68 29.50±1.47①23.42±1.10①②③20.23±0.92①②20.02±0.83①②215.011＜0.001

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織血管變化比較圖1結(jié)果顯示：正常組大鼠眼底血管分布均勻、熒光素?zé)o泄露；模型組大鼠視網(wǎng)膜組織有大量血管生成，且熒光素泄露嚴(yán)重；石斛提取物低劑量組大鼠眼底血管數(shù)量較模型組減少、熒光素泄露量降低，而石斛提取物高劑量組及陽性藥物組視網(wǎng)膜組織血管數(shù)量相對(duì)較少、幾乎無熒光素泄露。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織血管變化比較（FFA法）Figure 1 Comparison of vascular changes in rat retinal tissues among various groups（FFA method）

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化比較圖2結(jié)果顯示：正常組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)及內(nèi)外界膜清晰、神經(jīng)纖維層排列整齊，無顯著病理學(xué)變化；模型組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)疏松、內(nèi)外核層細(xì)胞排列混亂，可明顯觀察到組織水腫；石斛提取物低劑量組視網(wǎng)膜組織細(xì)胞排列稍混亂，出現(xiàn)不同程度組織水腫，神經(jīng)纖維層增厚；石斛提取物高劑量組和陽性藥物組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，神經(jīng)纖維層排列相對(duì)整齊，出現(xiàn)輕微的組織水腫。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化比較（HE染色法，×400）Figure 2 Comparison of histopathologicalchanges in rat retina among various groups（HE staining method，×400）

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量比較表3結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平降低（P＜0.05）；石斛提取物低、高劑量組視網(wǎng)膜組織IL-6、IL-1β、TNF-α水平高于陽性藥物組（P＜0.05）。

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量比較Table 3 Comparison of the inflammatory factor content in rat retinaltissues among various groups （±s，ng·L-1）

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織炎癥因子含量比較Table 3 Comparison of the inflammatory factor content in rat retinaltissues among various groups （±s，ng·L-1）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對(duì)照組比較；④P＜0.05，與石斛提取物低劑量組比較

組別對(duì)照組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數(shù)/只4 4 4 4 4 IL-6 86.24±1.69 131.04±1.76①116.08±1.24①②③97.50±1.58①②③④92.11±1.33①②584.507＜0.001 IL-1β 27.39±1.11 49.63±2.03①43.00±1.95①②③37.46±1.26①②③④32.28±1.87①②107.712＜0.001 TNF-α 285.17±35.12 507.82±42.37①450.69±43.69①②③402.11±38.33①②③④349.03±36.74①②19.245＜0.001

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF基因表達(dá)比較表4結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，石斛提取物低劑量組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05），而石斛提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)比較Table 4 Comparison of HIF-1αand VEGF gene expression in rat retinaltissues among various groups （±s）

表4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)比較Table 4 Comparison of HIF-1αand VEGF gene expression in rat retinaltissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對(duì)照組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數(shù)/只4 4 4 4 4 HIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量1.05±0.11 2.61±0.17①2.15±0.16①②③1.67±0.09①②1.76±0.10①②79.580＜0.001 VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量0.97±0.10 2.89±0.21①2.34±0.13①②③1.87±0.12①②1.96±0.17①②86.917＜0.001

2.6 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)比較圖3、表5結(jié)果顯示：視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，模型組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與模型組比較，石斛提取物低、高劑量組及陽性藥物組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，石斛提取物低劑量組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05），而石斛提取物高劑量組與陽性藥物組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of HIF-1αand VEGF in rat retinaltissues among various groups （±s）

表5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平比較Table 5 Comparison of protein expression levels of HIF-1αand VEGF in rat retinaltissues among various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與陽性對(duì)照組比較

組別正常組模型組石斛提取物低劑量組石斛提取物高劑量組陽性藥物組F值P值鼠數(shù)/只4 4 4 4 4 HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量0.60±0.08 0.97±0.10①0.83±0.04①②③0.72±0.05①②0.70±0.01①②19.350＜0.001 VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量0.23±0.05 0.59±0.09①0.47±0.03①②③0.34±0.02①②0.32±0.01①②33.083＜0.001

圖3 各組HIF-1α、VEGF蛋白的Western Blot電泳條帶Figure 3 Western Blot electrophoresis bands of HIF-1αand VEGF proteins

3 討論

炎癥和血管生成為糖尿病視網(wǎng)膜病變的兩個(gè)主要機(jī)制，其更多地作為相互影響而不是獨(dú)立起作用[12]。本研究采用FFA法結(jié)果顯示：石斛提取物低劑量組大鼠眼底血管數(shù)量較模型組減少、熒光素泄露量降低，而石斛提取物高劑量組及陽性藥物組視網(wǎng)膜組織血管數(shù)量相對(duì)較少、幾乎無熒光素泄露；HE結(jié)果顯示，石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽性藥物組視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)外核層細(xì)胞排列以及細(xì)胞組織水腫均較模型組呈現(xiàn)出不同程度的改善，其中高劑量組和陽性藥物組大鼠視網(wǎng)膜組織改善更為明顯，且療效相當(dāng)。結(jié)果表明，石斛乙醇提取物可有效抑制T2DM大鼠視網(wǎng)膜新生血管形成，改善大鼠視網(wǎng)膜病變。

炎癥是糖尿病和代謝綜合征發(fā)病過程的核心環(huán)節(jié)。慢性炎癥可引起胰島素抵抗增加和葡萄糖代謝紊亂[13]。本研究結(jié)果顯示：石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽性藥物組視網(wǎng)膜組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β水平較模型組降低，且高劑量組的改善效果與陽性藥物組相當(dāng)。結(jié)果表明石斛乙醇提取物可減輕T2DM大鼠炎性反應(yīng)，改善視網(wǎng)膜病變。

HIF是一種成熟且有效的血管生成刺激劑，可誘導(dǎo)缺氧細(xì)胞促血管生成因子VEGF轉(zhuǎn)錄[14]。HIF-α信號(hào)在炎癥啟動(dòng)或調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用[15]。VEGF是視網(wǎng)膜血管通透性和血管生成的有效誘導(dǎo)劑，通過與相對(duì)應(yīng)受體結(jié)合，誘導(dǎo)并參與新生血管形成[16]。HIF因子蓄積可促進(jìn)VEGF基因表達(dá)，加劇以血管過度增殖或產(chǎn)生促癌作用為特征的病理變化[17]。本研究結(jié)果顯示，石斛乙醇提取物低、高劑量組與陽性藥物組視網(wǎng)膜組織HIF-1α、VEGF mRNA表達(dá)較模型組降低，且高劑量組與陽性藥物組療效相當(dāng)，表明石斛乙醇提取物可有效調(diào)控T2DM大鼠視網(wǎng)膜血管的生成作用靶點(diǎn)。

VEGF表達(dá)量與糖尿病視網(wǎng)膜病變程度存在顯著相關(guān)性[18]。已有研究[19]結(jié)果表明，對(duì)T2DM視網(wǎng)膜的保護(hù)作用可通過調(diào)控HIF-1α/VEGF軸實(shí)現(xiàn)。陽性對(duì)照藥物羥苯磺酸鈣可作用于VEGF和相對(duì)應(yīng)受體信號(hào)通路抑制視網(wǎng)膜微血管形成[20]。本研究結(jié)果顯示，石斛乙醇提取物可有效降低T2DM大鼠HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá)，效果與羥苯磺酸鈣相當(dāng)，表明石斛乙醇提取物可能通過抑制HIF-α和VEGF的蛋白表達(dá)，參與調(diào)節(jié)血管生成，從而抑制T2DM大鼠視網(wǎng)膜微血管生成。

綜上所述，石斛乙醇提取物可有效抑制T2DM大鼠眼底視網(wǎng)膜血管生成，其機(jī)制可能與調(diào)控HIF-1α/VEGF軸相關(guān)信號(hào)分子mRNA和蛋白表達(dá)及下游促炎癥因子有關(guān)。