內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌分離鑒定及耐藥性試驗

趙紅霞 , 王曉凱 , 宋 晨 , 郭文瑞 , 郝普國 , 郭 宇 , 呂向聰 , 麻海瀾 , 周偉光 , 樊宏亮

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010 ; 2.鄂爾多斯生態(tài)環(huán)境職業(yè)學(xué)院 , 內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000 ; 3.內(nèi)蒙古動物疫病預(yù)防控制中心 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010 ; 4. 內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司 , 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

奶牛子宮內(nèi)膜炎是奶牛產(chǎn)后常發(fā)疾病之一，不僅會引起配種時間推遲、產(chǎn)犢間隔延長和產(chǎn)奶量降低，嚴(yán)重時還會導(dǎo)致奶牛屢配不孕，甚至繼發(fā)其他疾病或死亡。在歐洲和北美，奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生率在9.40%～67.00%，而中國奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病率在20%～50%[1]。內(nèi)蒙古自治區(qū)作為我國重要的奶牛養(yǎng)殖優(yōu)勢區(qū)和乳制品加工生產(chǎn)區(qū)，奶牛存欄、奶產(chǎn)量均居全國前列，由于飼養(yǎng)管理水平低等眾多因素，奶牛子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生率較高，因該病淘汰母牛比例高于50%，給該地區(qū)奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，阻礙其健康發(fā)展。

相關(guān)研究報道，奶牛子宮內(nèi)膜炎主要由細(xì)菌、真菌、支原體、病毒和寄生蟲引起，細(xì)菌是引起該病最主要的病原[2]。其中，以金黃色葡萄球菌、鏈球菌、沙門菌、大腸桿菌、化膿棒狀桿菌和地衣芽孢桿菌最為常見[3]。目前，奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療主要以抗菌藥物為主，由于臨床治療中頻繁地使用甚至是濫用抗菌藥物，導(dǎo)致奶牛源性病原菌耐藥性增強，給該病的防治帶來了更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。本試驗對引起內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原菌進行分離鑒定，并通過體外藥物敏感試驗測定這些病原菌對常用抗菌藥的敏感性,旨在闡明該地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的感染情況、致病菌的類型及其對常用抗菌藥物的耐藥情況，以期為科學(xué)、合理地防治奶牛子宮內(nèi)膜炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 25923、ATCC 25922和ATCC 49619，均購自中國食品藥品檢定研究院；標(biāo)準(zhǔn)菌株CICC 21482，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；試驗菌株從呼和浩特周邊奶牛場采集的260份子宮內(nèi)膜炎病料中分離獲得。

1.2 主要試劑藥品 普通營養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；革蘭染色液、Barid-Parker(B-P)瓊脂培養(yǎng)基、水解酪蛋白肉湯(MH肉湯)、血瓊脂培養(yǎng)基，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；SS瓊脂、金黃色葡萄球菌、鏈球菌生化鑒定管、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管，均購自杭州天和微生物試劑有限公司；鏈霉素、慶大霉素、青霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢噻呋等44種抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 主要儀器 HDL360超凈工作臺，購自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HPS-250生化培養(yǎng)箱，購自哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；T6紫外可見光分光光度計，購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.4 病料采集 從呼和浩特市周邊奶牛場選取260例患臨床型子宮內(nèi)膜炎且未進行藥物治療的病牛，用無菌采樣拭子采集子宮內(nèi)分泌物，密封后盡快(4 h內(nèi))送回實驗室進行細(xì)菌分離、鑒定。

1.5 細(xì)菌的分離鑒定

1.5.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集的病料在無菌肉湯中進行37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，分別劃線接種于SS瓊脂平板、含5%脫纖維綿羊血的MH瓊脂平板、伊紅美藍瓊脂平板、B-P瓊脂平板，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別挑取4種平板上生長狀態(tài)良好的單個典型菌落，進行革蘭染色、鏡檢。根據(jù)細(xì)菌的菌落形態(tài)、生長特性及顯微鏡下細(xì)菌的染色和形態(tài)特征，對分離菌進行初步鑒定。

1.5.2 分離菌的生化鑒定 將疑似菌分別接種到相應(yīng)培養(yǎng)基上進行純化，采用細(xì)菌生化鑒定管對純化的4種菌進行生化鑒定。4種分離菌的生化鑒定，具體操作參照參考文獻[4-7]報道的試驗方法進行。

1.6 藥敏試驗 采用微量稀釋法，具體操作參照參考文獻[4-7]報道的試驗方法進行。依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)2015年推薦的藥敏試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)進行判定。當(dāng)達到質(zhì)控要求，且培養(yǎng)液對照孔不長菌，試驗菌株對照孔有細(xì)菌生長，而藥液對照孔也無細(xì)菌生長時，表明藥敏試驗結(jié)果可信，此時可記錄藥敏試驗結(jié)果。當(dāng)“U”型孔底有肉眼可見的細(xì)菌生長而形成的圓形斑點時，認(rèn)為該孔藥物不抑制細(xì)菌的生長。而當(dāng)“U”型孔內(nèi)清亮、無菌生長時，認(rèn)為該濃度藥物可抑制細(xì)菌的生長，每株菌每種藥物各濃度的3個重復(fù)細(xì)菌生長情況均一致時，方可記錄結(jié)果并確定最小抑菌濃度(MIC)值。將藥敏試驗的結(jié)果用敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐藥(Resistant)表示。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 從260份奶牛子宮內(nèi)膜炎病料中分離得到的主要病原菌有大腸桿菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌。4種分離菌的菌株數(shù)及檢出率見表1。

表1 260份樣本菌株分離概況Table 1 Bacterial isolates from 260 samples

2.2 4種分離菌的生化鑒定 結(jié)果見表2～表5,4種分離菌均符合相應(yīng)菌種的生化特性。

表2 大腸桿菌的生化鑒定Table 2 Biochemical identification of Escherichia coli

表3 鏈球菌的生化鑒定Table 3 Biochemical identification of Streptococcus

表4 金黃色葡萄球菌的生化鑒定Table 4 Biochemical identification of Staphylococcus aureus

表5 沙門菌的生化鑒定Table 5 Biochemical identification of Salmonella

2.3 4種分離菌的藥敏試驗

2.3.1 大腸桿菌的藥敏試驗 126株大腸桿菌對21種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表6，分離菌對磺胺類、芐胺嘧啶類藥物的耐藥率均超過98%;對四環(huán)素類的四環(huán)素、土霉素的耐藥率達70%以上；對青霉素類的氨芐西林、阿莫西林，氨基糖苷類的卡那霉素、鏈霉素以及四環(huán)素類的多西環(huán)素、多黏菌素E的耐藥率在50%～60%；對頭孢噻吩、阿米卡星、呋喃唑酮和氟喹諾酮類藥物的耐藥率均在20%～35%，較為敏感;對頭孢噻呋的耐藥率僅為13.7%。

表6 126株大腸桿菌的藥敏試驗Table 6 Drug sensitivity test of 126 Escherichia coli isolates (%)

2.3.2 鏈球菌的藥敏試驗 84株鏈球菌對19種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表7，分離菌對四環(huán)素、卡那霉素、β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥情況嚴(yán)重，耐藥率在80%以上，但對美羅培南的耐藥率較低(47.4%)；對克林霉素、紅霉素、羅紅霉素和慶大霉素的耐藥率在50%～70%；對萬古霉素較為敏感，耐藥率為26.7%；對3種氟喹諾酮類藥物高度敏感，耐藥率在2%～5%。

表7 84株鏈球菌的的藥敏試驗Table 7 Drug sensitivity test of 84 Streptococcus isolates (%)

2.3.3 金黃色葡萄球菌的藥敏試驗 53株金黃色葡萄球菌對16種抗菌藥物和3種組合藥物的藥敏試驗結(jié)果見表8，分離菌對β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率在60%～85%；對紅霉素、四環(huán)素類的四環(huán)素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素的耐藥率介于40%～50%；對克林霉素較敏感，耐藥率為37.7%；對氟喹諾酮類藥物的耐藥率在20%～30%；對慶大霉素和3種組合的抗菌藥物的耐藥性弱，耐藥率在7.5%～13.2%；分離菌對萬古霉素完全敏感。

2.3.4 沙門菌的藥敏試驗 21株沙門菌對19種抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表9，沙門菌對甲氧芐啶和卡那霉素的耐藥率均在90%以上；對慶大霉素、四環(huán)素類的土霉素、多西環(huán)素和β-內(nèi)酰胺類藥物的耐藥率均在75%～90%；但對頭孢噻肟較為敏感，耐藥率為29.0%；對氨基糖苷類的阿米卡星和妥布霉素比較敏感，耐藥率低于10%；以上分離菌株未見對4種氟喹諾酮類藥物耐藥。

3 討論

本試驗對內(nèi)蒙古地區(qū)260份奶牛子宮內(nèi)膜炎病料進行了病原菌的分離鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引起內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌為大腸桿菌(48.5%)、鏈球菌(32.3%)、金黃色葡萄球菌(20.4%)和沙門菌(8.1%)。趙清梅等[8]報道引起寧夏地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要致病菌為大腸桿菌(55.56%)、金黃色葡萄球菌(35.9%)，這2種致病菌的分離率均高于本試驗中內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離率。李蕊等[9]報道保定市奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌主要為金黃色葡萄球菌、鏈球菌、大腸桿菌，該研究報道的奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌的種類與本試驗結(jié)果基本一致。胡文舉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，河南平頂山地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎主要致病菌種類除大腸桿菌外，還有蠟樣芽孢桿菌和奧斯陸莫拉菌等，這可能與奶牛品種、地區(qū)不同及飼養(yǎng)管理差異等因素有關(guān)。

藥敏試驗結(jié)果顯示，4種分離菌對抗菌藥物均產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。大腸桿菌和沙門菌對磺胺類藥物具有較高耐藥性，耐藥率高于97%，這可能與臨床中不規(guī)范使用此類藥物有關(guān)。本試驗結(jié)果中，鏈球菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌對青霉素類藥物耐藥率均在75%以上，譚春萍等[11]報道的廣西地區(qū)引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的致病菌對該類藥物的耐藥率為95.65%，其原因可能與此類治療藥物的長期使用有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，4種致病菌均對氟喹諾酮類藥物高度敏感，這與郭素風(fēng)等[12]報道的寧夏地區(qū)和麻延峰等[13]報道的金華地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌對氟喹諾酮類藥物敏感情況一致。因此，臨床上推薦使用氟喹諾酮類藥物作為治療奶牛子宮內(nèi)膜炎疾病的首選藥物。

綜上所述，本試驗對內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛子宮內(nèi)膜炎致病菌的分離、鑒定及藥敏試驗工作可為臨床獸醫(yī)人員提供參考，從而提高本病的治愈率。在生產(chǎn)中對于該病應(yīng)采取綜合防治措施，包括加強飼養(yǎng)管理，定期對環(huán)境進行消毒，減少致病菌的傳播；嚴(yán)格遵守人工輸精、子宮沖洗等操作規(guī)程，及時監(jiān)測奶牛產(chǎn)后21 d內(nèi)的子宮復(fù)舊情況，及早發(fā)現(xiàn)并盡早治療[14]；利用抗菌藥物治療的同時可以使用微生物制劑、激素類藥物、中草藥制劑等共同防治奶牛子宮內(nèi)膜炎，減少該病對奶牛場造成的經(jīng)濟損失[15]。