牦牛多殺性巴氏桿菌烈性噬菌體的生物學特性與全基因組序列分析

魏 歆 ， 馬凱茹 ， 趙 猛 ， 閆艷新 ， 孫虎芝 ， 潘 強 , 桂林生 ， 張紅見 ， 任慧英 ， 趙 靜

(1.青海大學農(nóng)牧學院 ， 青海 西寧 810016 ； 2.青島諾安百特生物技術(shù)有限公司 ， 山東 青島 266109 ；3.青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 山東 青島 266109)

牦牛出血性敗血癥是由B型多殺性巴氏桿菌引起的青海省牦牛的一種常發(fā)病，該病可給畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[1]。王生祥等[2]研究表明該病發(fā)病率低，僅為2.85%，而致死率高，達52.31%。針對該病常使用疫苗和抗生素進行防控，但疫苗太過單一，抗體效價低，抗生素多重耐藥現(xiàn)象嚴重[3]，這給臨床防治牦牛出血性敗血癥帶來了巨大困難[4]。

噬菌體裂解率高，1個噬菌體顆粒只需經(jīng)過4個裂解周期，便可以殺死約10億個細菌[5]，這一特性使噬菌體在治療細菌性疾病方面顯示出巨大的潛力[6-9]。本試驗分離得到1株牦牛多殺性巴氏桿菌烈性噬菌體，通過對其進行生物學特性研究以及全基因組測序分析，旨在為其能否開發(fā)成一種防治牦牛出血性敗血癥的新型生物制劑的提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗所用菌株 多殺性巴氏桿菌S34由本實驗室從患病牦牛肺臟分離；CVCC453等12株標準菌株，均購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；P0910系青海省祁連縣牦牛源多殺性巴氏桿菌分離株，P0825系青海省同德縣豬源多殺性巴氏桿菌分離株，P0903系青海省尖扎縣藏羊源多殺性巴氏桿菌分離株，均由青海大學傳染病實驗室保存；C45-2系多殺性巴氏桿菌疫苗株，購自蘭州獸醫(yī)藥品廠。

1.2 試劑及主要培養(yǎng)基 胰蛋白大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白大豆肉湯(Tryptic soy broth，TSB)，均購自英國OXOID公司；新生犢牛血清，購自上海源葉生物科技有限公司；DNA提取試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 樣品來源 從青海省黃南藏族自治州尖扎縣龍知養(yǎng)殖場、金龍養(yǎng)殖合作社、萬瑪生態(tài)養(yǎng)殖社、康楊鎮(zhèn)泰農(nóng)養(yǎng)殖合作社以及3個牦牛散養(yǎng)農(nóng)戶共7個采樣點，分別采集牦牛糞便和污水混合物500 mL，共計7份樣品。

1.4 多殺性巴氏桿菌的復蘇 將用甘油保存在-80 ℃的1.1中的菌株于TSA血清平板上分區(qū)劃線，過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落接種于5 mL含5%犢牛血清的TSB中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)18 h至對數(shù)期備用。

1.5 多殺性巴氏桿菌噬菌體的分離純化及效價測定 將糞便和污水混合物裝入含有宿主菌和液體培養(yǎng)基的樣品瓶中振搖培養(yǎng)，用雙層平板法[10]檢測有無噬菌斑并進行純化。將純化后的噬菌斑取斑浸出，取等量噬菌體和宿主菌加至含有5%犢牛血清的5 mL TSB中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，直到液體變澄清為止。將增殖好的噬菌體按10倍倍比稀釋，雙層平板法測定其效價，然后用甘油保存于-80 ℃冰箱中。

1.6 噬菌體透射電鏡觀察 取效價達到108～109PFU/mL的噬菌體增殖液，懸空滴加20 μL到銅網(wǎng)上，再在銅網(wǎng)上滴加15 μL的2%磷鎢酸染料染色，用透射電鏡觀察該噬菌體的形態(tài)。

1.7 噬菌體熱穩(wěn)定性測定 各取500 μL的噬菌體增殖液分裝于1.5 mL離心管中，分別置于50、60 ℃和70 ℃水浴中作用20、40 min和60 min，每個溫度做3個重復。處理完畢后，立即放入冰箱中冷卻，使用雙層平板法測定其效價。

1.8 噬菌體pH測定 在3支試管中加入不同pH(4.0、5.0、6.0、9.0、10.0)的TSB 4.5 mL，再各加入500 μL噬菌體增殖液，混勻，37 ℃水浴作用1、2 h和3 h，然后加入適量1 mol/L的HCl或NaOH，使混合液的pH為7.0，按10倍倍比稀釋到合適梯度，使用雙層平板法測定噬菌體的效價，每組做3個重復。以作用時間為橫坐標，噬菌體效價的對數(shù)值為縱坐標繪制pH曲線。

1.9 噬菌體最佳感染復數(shù)(MOI)測定 增殖多殺性巴氏桿菌噬菌體和宿主菌，將菌液和噬菌體濃度分別調(diào)整為1.0×108CFU/mL和1.0×109PFU/mL，保持菌液濃度不變，對噬菌體作系列稀釋，取等量的菌液和噬菌體液混合，使噬菌體與宿主菌的比值為1、0.1、0.01、0.001、0.000 1和0.000 01，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至液體變澄清，12 000 r/min離心5 min，取上清，測定噬菌體的滴度。

1.10 噬菌體裂解譜測定 采用點斑法[10]測定噬菌體裂解譜，取100 μL待測菌用無菌棉棒均勻涂在TSA上，待菌液充分吸收后，取1 μL噬菌體增殖液滴到涂好菌液的TSA血清平板上，置于37 ℃過夜培養(yǎng)。

1.11 噬菌體的一步生長曲線繪制 按參考文獻[10]進行。

1.12 噬菌體Pa7全基因組測序及分析 按照DNA提取試劑盒中的說明書提取噬菌體DNA。采用Illumina 測序技術(shù)進行噬菌體的基因組掃描測序，構(gòu)建Illumina PE文庫。用SPAdes 軟件完成基因組的拼接，用 GeneMarkS軟件對新測序的基因組進行編碼基因預測。將預測基因的蛋白序列分別與 Nr、COG、eggNOG、KEGG、Swissprot 和 GO 數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對(BLAST 2.2.30+，比對標準：E值不大于1e-5)。通過Blast2GO軟件對BLAST結(jié)果進行GO 注釋分析。使用在線工具tRNAscan-SE預測有無tRNA基因[11]，用CGE server檢測基因組的耐藥基因，用MEGAX軟件對噬菌體進行分子系統(tǒng)發(fā)育分析[12]。

2 結(jié)果

2.1 多殺性巴氏桿菌的分離純化及效價測定 采用雙層平板法從7份牦牛糞便和污水混合物中分離到1株裂解性噬菌體vB_PmuP_Pa7(簡稱Pa7)，測定噬菌體的滴度為1.18×108PFU/mL。經(jīng)培養(yǎng)純化至4代后，平板上可見噬菌體形態(tài)呈圓形、透亮、邊緣清晰，直徑約2 mm，外圍有一圈約1 mm的半透明光暈的噬菌斑，見圖1。

圖1 噬菌體Pa7的噬菌斑(第4代)Fig.1 Plaque of phage Pa7 (4th generation)

2.2 噬菌體透射電鏡觀察 純化后的噬菌體經(jīng)過磷鎢酸染料染色后，在透射電鏡下可見其頭部為正廿多面體，直徑約55 nm，還有一直徑約20 nm的短尾，見圖2。

圖2 噬菌體Pa7電鏡下的形態(tài)Fig.2 Morphology of phage Pa7 under transmission electron microscope

2.3 噬菌體熱穩(wěn)定性 經(jīng)過各個溫度梯度、不同時間條件下水浴處理后，噬菌體Pa7在50 ℃時，效價基本保持不變；在60 ℃和70 ℃作用20 min時，效價下降3個梯度；在60 ℃作用40 min 時，效價下降4個梯度；在60 ℃作用60 min和70 ℃作用40 min時，效價下降6個梯度；在70 ℃作用60 min時噬菌體基本失活，見圖3。由此可知Pa7能耐受一定的高溫，60 ℃以上不穩(wěn)定。

圖3 噬菌體Pa7熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of phage Pa7

2.4 噬菌體pH 經(jīng)過不同酸堿溶液處理后，結(jié)果顯示噬菌體Pa7能夠耐受一定的酸堿環(huán)境，在pH為5～9時其效價較為穩(wěn)定，隨著pH的進一步升高或降低，其活性顯著下降，見圖4。

圖4 噬菌體Pa7 pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of phage Pa7

2.5 噬菌體最佳MOI 當MOI為0.01時，噬菌體Pa7的效價最高，此時滴度為2.83×108PFU/mL，由此可確定噬菌體Pa7的最佳MOI為0.01，見表1。

表1 噬菌體Pa7的最佳感染復數(shù)Table 1 Optimal MOI of phage Pa7

2.6 噬菌體裂解譜 采用點斑法測定噬菌體的裂解譜，結(jié)果顯示Pa7僅對莢膜血清B型多殺性巴氏桿菌具有裂解性，對莢膜血清A型、D型、E型和F型的多殺性巴氏桿菌都不具有裂解性，表明該噬菌體具有高度的特異性，見表2。

表2 噬菌體Pa7的裂解譜范圍Table 2 Range of lytic spectrum of phage Pa7

2.7 噬菌體的一步生長曲線 Pa7的潛伏期大約持續(xù)15 min，在感染后的20～120 min內(nèi)，噬菌體的數(shù)量呈上升趨勢，該階段為噬菌體的爆發(fā)期，120 min后逐漸趨于平穩(wěn)。根據(jù)裂解量的計算公式可以計算出噬菌體的裂解量為162 PFU/cell，見圖5。

圖5 噬菌體Pa7的一步生長曲線Fig.5 One-step growth curve of phage Pa7

2.8 噬菌體Pa7基因組測序結(jié)果分析 全基因組測序結(jié)果顯示，Pa7基因組為雙鏈DNA，基因組大小長度為37 402 bp，G+C含量為40.9%。Pa7基因組不含tRNA基因和耐藥基因。該基因組含有41個開放閱讀框(ORFs)，其中已知編碼功能蛋白的有21個，其余的20個ORFs被預測為假定蛋白(Hypothetical protein)。Pa7核酸總長度為34 527 bp，占全基因組的92.31%，平均長度達到842 bp，基因組顯示出很高的基因密度，類似于其他有尾dsDNA噬菌體。全基因組序列已提交GenBank，登錄號為MT902335，見表3。

表3 噬菌體Pa7的41個ORFs基因功能注釋Table 3 Functional annotation of 41 ORFs genes of phage Pa7

2.9 基因組模式圖 根據(jù)表3的結(jié)果，用IBS軟件繪制噬菌體Pa7的基因組模式圖。如圖6所示，將噬菌體Pa7每個ORFs所行使的功能分為噬菌體的包裝和結(jié)構(gòu)蛋白模塊：噬菌體DNA包裝蛋白A等；噬菌體的裂解模塊：噬菌體尾絲蛋白、N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶、穴蛋白等；噬菌體代謝和調(diào)控模塊:單鏈DNA結(jié)合蛋白、核酸內(nèi)切酶Ⅰ、內(nèi)肽酶等。

圖6 噬菌體Pa7基因組模式Fig.6 Genome structure of phage Pa7

2.10 Pa7的全基因組比對及進化樹分析 Pa7 Blastn比對分析結(jié)果顯示，其與巴氏桿菌噬菌體PHB02、PHB01具有較高的同源性，其中與Pa7同源性最高的噬菌體為PHB02(GenBank登錄號為NC_047831.1)，具有97.56%的相似性以及99%的覆蓋率，見圖7。

圖7 噬菌體Pa7與同源性噬菌體的基因組比對圈圖Fig.7 Genomic alignment of phage Pa7 with homologous phages

選取較為保守的噬菌體蛋白序列即DNA聚合酶構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以分析Pa7與其他噬菌體之間的進化關(guān)系，見圖8。

圖8 噬菌體Pa7 DNA聚合酶(ORF18)氨基酸序列的進化樹分析Fig.8 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequence of phage Pa7 DNA polymerase (ORF18)▲:本試驗分離株▲:The strain isolated in this experiment

3 討論

牦牛出血性敗血癥給青海省養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生帶來了巨大的經(jīng)濟損失和安全隱患。由于其病原多重耐藥現(xiàn)象嚴重且疫苗抗體效價低，導致牦牛出血性敗血癥屢年發(fā)生。本試驗獨辟蹊徑，瞄準噬菌體對細菌特異、高效殺傷這一研究熱點，從臨床篩選獲得了1株青海省地方血清型B型巴氏桿菌烈性噬菌體Pa7，為抗菌藥物減量化研究提供了候選毒株。但要將Pa7作為臨床治療牦牛出血性敗血癥的生物制劑，還需要建立動物模型對其安全性、給藥方式以及用量等進行進一步研究，以減少臨床用藥所帶來的污染。

目前除了涉及A、D型多殺性巴氏桿菌噬菌體的研究外[13-14]，國內(nèi)外鮮有其他血清型噬菌體的報道。本試驗分離到的Pa7只裂解B型多殺性巴氏桿菌，而對其他種無裂解活性，說明該噬菌體具有專一性；生物學特性研究表明，Pa7最適溫度為50 ℃左右，60 ℃以上不穩(wěn)定；最適pH為5.0～9.0，比孫二超[13]報道的豬多殺性巴氏桿菌噬菌體PHB02最適pH 3.0～9.0稍高，這有利于噬菌體在牦牛出血性敗血癥治療中發(fā)揮抗菌作用。pH會影響噬菌體吸附蛋白和宿主菌受體的空間結(jié)構(gòu)，它的高低則會影響噬菌體與宿主菌的結(jié)合[10]。在臨床應用中，動物胃酸環(huán)境是制約口服噬菌體治療效果的因素之一，有學者建議給動物飼喂飼料之后，再口服噬菌體制劑，可避免胃腔內(nèi)低pH對噬菌體的影響[15]。

根據(jù)噬菌體Pa7的一步生長曲線可知，Pa7的潛伏期大約持續(xù)15 min，在感染后的20～120 min內(nèi)，噬菌體的數(shù)量呈上升趨勢，是該噬菌體的爆發(fā)期，120 min后逐漸趨于平穩(wěn)，其裂解量為162 PFU/cell，相較Schatner等[11]報道的噬菌體的爆發(fā)量68 PFU/cell高很多，推測Pa7對牦牛多殺性巴氏桿菌的殺菌力較強，具有開發(fā)為防治牦牛出血性敗血癥新型環(huán)保生物制劑的潛力。

通過對Pa7進行全基因組測序，結(jié)合電鏡觀察，結(jié)果顯示該噬菌體為有尾噬菌體目，短尾噬菌體科，T7-like噬菌體。其基因組含有41個ORFs，編碼功能蛋白的有21個，主要涉及核苷酸代謝和復制、結(jié)構(gòu)和包裝以及細菌裂解。據(jù)分析其中由ORF11編碼1個單鏈DNA結(jié)合蛋白，與耶爾森氏菌噬菌體Yep-phi的單鏈DNA結(jié)合蛋白具有44.67%的同源性，它可以激活DNA聚合酶和解旋酶[16]；ORF23編碼的1種核酸外切酶與大腸桿菌噬菌體P694的核酸外切酶有55.9%的同源性，可催化宿主細菌dsDNA水解成單核苷酸，它們均可能參與DNA的修復和重組[17]；由ORF31編碼的噬菌體尾絲蛋白與寡養(yǎng)單胞菌噬菌體IME15的尾絲蛋白同源性為62.97%，與大腸桿菌T7噬菌體的同源性為62.01%，噬菌體通過尾絲蛋白來識別宿主[17]，在噬菌體自身增殖和感染中起著關(guān)鍵作用；ORF13編碼的N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶屬于第二類內(nèi)溶素；ORF37編碼的穴蛋白先在細菌細胞膜上造成大量的空隙，再由ORF13編碼的N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶作為第二類內(nèi)溶素，與穴蛋白形成一個完整的裂解路徑，使缺乏信號肽的內(nèi)溶素可以穿過細菌細胞膜，然后迅速裂解宿主菌并釋放出大量的子代噬菌體，起著輔助內(nèi)溶素裂解宿主菌的作用[18-19]，為篩選出具有高效保護效果的候選噬菌體進行基因工程改造提供了思路。