偽狂犬病病毒TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

呂玉金 ， 張世軍 ， 吳鳳筍 ， 趙攀登 ， 劉玲玲 ， 李文剛 ， 饒 寶

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002 ；3.牧原食品股份有限公司 ， 河南 南陽(yáng) 473000)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，在自然界中廣泛存在，是引起豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)的病原體。PRV唯一的自然宿主是豬，仔豬感染后表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，死亡率可達(dá)100%；成年豬感染后通常表現(xiàn)為呼吸道癥狀和增重減緩，急性感染耐過(guò)的豬則終身隱性帶毒；懷孕母豬感染后常發(fā)生繁殖障礙[1-2]。20世紀(jì)80年代以來(lái)，Bartha-K61等疫苗的使用對(duì)PRV的傳播和危害起到了有效的控制作用。但2011年后，由于PRV發(fā)生變異導(dǎo)致病毒的毒力增強(qiáng)，豬偽狂犬病再次暴發(fā)，由華中地區(qū)陸續(xù)流行到華南、華北及西南等地區(qū)的已經(jīng)免疫過(guò)弱毒疫苗的豬場(chǎng)，且Bartha-K61等傳統(tǒng)弱毒疫苗不能對(duì)目前PRV流行毒株提供有效的免疫保護(hù)[3-6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外多次出現(xiàn)PRV感染人的報(bào)道，加速了PRV根除凈化警報(bào)[7-9]。因此，快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)該病的防控具有重要意義。

本試驗(yàn)基于國(guó)內(nèi)PRV野毒株基因序列，根據(jù)PRVgB和gE基因保守區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立可用于臨床樣本中PRV野毒株和疫苗株檢測(cè)的TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，旨在為PRV的檢測(cè)和防控提供有效的保障。

1 材料與方法

1.1 病毒株及臨床樣品 病料組織于2020年6月采集自河南省新鄉(xiāng)市某一豬場(chǎng)；PRV Bartha-K61疫苗株，購(gòu)自武漢科前生物有限公司；PRV陽(yáng)性對(duì)照毒株HNJY株、豬腎細(xì)胞(PK-15)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬乙型腦炎病毒(JEV)，均由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器 pMD18-T Vector、ExTaq酶和PremixExTaqTM(Probe qPCR),均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。ABI-7500 Fast熒光定量PCR儀，購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì) 利用DNASTAR(Version 5.0)軟件對(duì)GenBank 中2012年以來(lái)公布的PRV流行毒株gE和gB基因序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析(圖1和圖2)，選擇各自保守區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物和探針，并將探針標(biāo)記上不同的發(fā)光基團(tuán)，使其能夠區(qū)分野毒株和疫苗株，引物和探針序列見(jiàn)表1。

圖1 PRV-gE引物和探針設(shè)計(jì)Fig.1 Design of PRV-gE primers and probe

圖2 PRV-gB引物和探針設(shè)計(jì)Fig.2 Design of PRV-gB primers and probe

表1 熒光定量PCR引物和探針Table 1 Primers and probe of fluorescence quantitative PCR

1.4 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以本實(shí)驗(yàn)室保存的PRV病毒的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的片段。將PCR目的片段膠回收純化克隆至pMD18-T Vector中，并將重組載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液鑒定和一代測(cè)序，篩選陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，得到pMD-gB和pMD-gE重組質(zhì)粒。使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度，根據(jù)公式(1)換算出拷貝數(shù)[10]。

拷貝數(shù)(copies/μL)=[6.02×1023×質(zhì)粒濃度(ng/μL)×10-9]÷[660×(pMD18-T)載體堿基數(shù)+目的片段堿基數(shù)]

(1)

1.5 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用20 μL反應(yīng)體系：PremixExTaq(Probe qPCR)(2×Conc) 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×Conc) 0.4 μL，DNA模板2 μL，TaqMan探針(10 μmol/L)和上下游引物(10 μmol/L)的終濃度在0.1～0.8 μmol/L調(diào)整，用超純水補(bǔ)齊至20 μL。然后對(duì)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR各循環(huán)參數(shù)和引物濃度等進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系。

1.6 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取PRV-gE、PRV-gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?；靹?，進(jìn)行10倍倍比梯度稀釋，以各個(gè)梯度重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)最適條件進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)數(shù)量級(jí)重復(fù)3次，得出結(jié)果進(jìn)行分析，以對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)為橫軸，Ct值為縱軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

1.7 特異性試驗(yàn) 利用本試驗(yàn)建立的TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別對(duì)PRV-gE重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、PRV-gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、PRV野毒株、PRV Bartha-K61疫苗株、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2和JEV進(jìn)行檢測(cè)，分析該方法的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn) 取濃度數(shù)量級(jí)為100～107copies/μL的重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為DNA模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，以確定該方法的最低檢測(cè)限度。隨后利用普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增[12]，分析檢測(cè)結(jié)果得出最低檢測(cè)濃度，并與本試驗(yàn)建立的TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法進(jìn)行靈敏性對(duì)比。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取濃度數(shù)量級(jí)為104～106copies/μL 共3個(gè)稀釋度DNA為模板，分別進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增，進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)。根據(jù)所得結(jié)果的Ct值，計(jì)算Ct值的平均數(shù)(MN)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)[13],最后根據(jù)公式(2)計(jì)算變異系數(shù)(CV)[14]來(lái)驗(yàn)證實(shí)時(shí)熒光定量PCR的批內(nèi)重復(fù)性。

CV=(SD÷MN)×100%

(2)

1.10 干擾性試驗(yàn) 將PRV-gB和PRV-gE重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按不同的拷貝數(shù)進(jìn)行組合，分別用雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR和單項(xiàng)熒光PCR進(jìn)行檢測(cè)，確定模板濃度相差較大時(shí)二者的檢測(cè)是否存在干擾。

1.11 臨床樣品檢測(cè) 按照生工生物工程(上海)股份有限公司DNA抽提試劑盒說(shuō)明書對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的18份豬臨床病料進(jìn)行基因組提取，采用所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)病料進(jìn)行檢測(cè)。隨后利用普通PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增[12]，分析檢測(cè)結(jié)果，并與本試驗(yàn)建立的TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 對(duì)PRVgB和gE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠回收后與pMD18-T Vector連接，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，PRVgE基因的重組質(zhì)粒顯示2 061 bp和2 877 bp 2個(gè)條帶，PRVgB的重組質(zhì)粒顯示2 640 bp和2 877 bp 2個(gè)條帶，與預(yù)期大小一致(圖3)。對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行濃度測(cè)定，PRV-gB和PRV-gE重組質(zhì)粒的濃度分別為164.0 ng/μL和141.5 ng/μL，使用公式(1)計(jì)算其拷貝數(shù)分別為2.74×1010copies/μL和2.71×1010copies/μL。

圖3 PRV-gE和PRV-gB重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Double digestion identification of PRV-gE and PRV-gB recombinant plasmidsM：DL5 000 Marker； 1：PRV-gB雙酶切產(chǎn)物； 2：PRV-gE雙酶切產(chǎn)物M：DL5 000 Marker； 1：PRV-gB double enzymes digestion products；2：PRV-gE double enzymes digestion products

2.2 雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 經(jīng)過(guò)對(duì)TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定該反應(yīng)體系PRV-gB-F、PRV-gB-R、PRV-gE-F和PRV-gE-R引物的最佳工作終濃度為0.2 μmol/L，PRV-gB-P和PRV-gE-P探針的最佳工作終濃度分別為0.3 μmol/L和0.2 μmol/L；PCR的最佳反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，94 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)；最后于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。在最佳的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，對(duì)濃度數(shù)量級(jí)為102～108copies/μL的gE、gB基因的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒模板進(jìn)行檢測(cè)，建立雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖4所示，gE、gB基因線性方程分別為：gE：y=-3.154x+46.08；gB：y=-3.120 8x+45.235，相關(guān)系數(shù)分別為0.997 9和0.990 6，擴(kuò)增效率分別為99.626%和99.779%。

圖4 TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：PRV gE基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：PRV gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線A：Standard curve of PRV gE gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR；B：Standard curve of PRV gB gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR

2.3 特異性試驗(yàn) 分別采用所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖5所示，PRV野毒株、PRV-gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒和PRV Bartha-K61疫苗株在FAM熒光通道(530 nm激發(fā)光下)出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，PRV野毒株、PRV-gE重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在JOE熒光通道(478 nm激發(fā)光下)出現(xiàn)S型擴(kuò)增曲線，其他則在FAM和JOE熒光通道為直線，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。

圖5 TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性Fig.5 Specificity of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：PRV gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果(1：PRV-gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； 2：PRV野毒株； 3：PRV Bartha-K61疫苗株；4～9:PRV-gE重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2和JEV)； B：PRV gE基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果(1：PRV-gE重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； 2：PRV野毒株； 3～9：PRV-gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、PRV Bartha-K61疫苗株、CSFV、PRRSV、PPV、PCV2和JEV)A：PRV gB gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR specificity test results(1：PRV-gB recombinant standard plasmid； 2：PRV wild strain；3：PRV Bartha-K61 vaccine strain； 4-9:PRV-gE recombinant standard plasmid,CSFV,PRRSV,PPV,PCV2 and JEV)B：PRV gE gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR specificity test results(1：PRV-gE recombinant standard plasmid； 2：PRV wild strain；3-9: PRV-gB recombinant standard plasmid，PRV Bartha-K61 vaccine strain,CSFV,PRRSV,PPV,PCV2 and JEV)

2.4 敏感性試驗(yàn) 采用所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)PRVgE和gB基因的2種重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的混合品進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，結(jié)果顯示，建立的方法對(duì)PRVgB基因重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的模板最低檢測(cè)量為2.74 copies/μL(圖6A)，建立的方法對(duì)PRVgE基因重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的模板最低檢測(cè)量為27.1 copies/μL(圖6B)。

圖6 TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性Fig.6 Sensitivity of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：PRV gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果(1～7:PRV gB基因的重組質(zhì)粒的濃度分別為2.74～2.74×106 copies/μL)；B：PRV gE基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果(1～6:PRV gE基因的重組質(zhì)粒的濃度分別為27.1～2.71×106 copies/μL)A：PRV gB gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR sensitivity test results(1-7: PRV gB gene recombinant plasmids at 2.74-2.74×106 copies/μL)；B：PRV gE gene TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCR sensitivity test results(1-6: PRV gE gene recombinant plasmids at 27.1-2.71×106 copies/μL)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù)所得結(jié)果的Ct值，計(jì)算Ct值的MN、SD和CV，如表2所示，兩組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)均小于1%，結(jié)果表明本方法具有良好的重復(fù)性。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of repeatability test

2.6 干擾性試驗(yàn) 將PRV gE和gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板按不同濃度進(jìn)行組合時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一個(gè)模板濃度高而另一個(gè)模板濃度低時(shí)，仍可在不同的熒光通道下分別檢測(cè)到2個(gè)模板，并與單一熒光PCR檢測(cè)結(jié)果無(wú)顯著差異(圖7)。

圖7 TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的干擾性Fig.7 Robustness of TaqMan duplex real-time fluorescence quantitative PCRA：1：PRV gE重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度為2.71×108 copies/μL； 2：PRV gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度為2.74×103 copies/μL；B：1：PRV gE重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度為2.71×103 copies/μL； 2：PRV gB重組標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度為2.74×108 copies/μLA：1：PRV gE recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.71×108 copies/μL； 2：PRV gB recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.74×103 copies/μL； B：1：PRV gE recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.71×103 copies/μL； 2：PRV gB recombinant standard plasmid standard template concentration is 2.74×108 copies/μL

2.7 臨床樣品檢測(cè) 通過(guò)本試驗(yàn)建立的方法對(duì)保存的18份樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果如表3所示，18份病料中共檢出gB基因陽(yáng)性病料10份，陽(yáng)性率為55.6%；檢出gE基因陽(yáng)性病料7份，陽(yáng)性率為38.9%；混合感染病料為5份，占比27.8%，且該檢測(cè)結(jié)果與普通PCR方法鑒定結(jié)果符合率達(dá)100%。說(shuō)明本試驗(yàn)建立的TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)方法較適用于臨床樣品的檢測(cè)。

表3 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of clinical sample

3 討論

近年來(lái)，在我國(guó)許多地區(qū)都報(bào)告了PR的暴發(fā)，目前所使用的Bartha-K61疫苗不能為新型的PRV變異毒株提供足夠的保護(hù)。考慮到國(guó)內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模疫苗接種，豬群中可同時(shí)存在PRV野毒株和疫苗株。在豬偽狂犬病凈化過(guò)程中，開發(fā)區(qū)分不同PRV毒株的檢測(cè)方法是必要的，且需求日益增加[15]。

隨著研究的不斷深入，現(xiàn)已經(jīng)開發(fā)出很多可對(duì)PRV毒株進(jìn)行鑒定的方法。謝思豪等[16]建立了PRV野毒株新型可視化LAMP檢測(cè)方法，其結(jié)果直觀且極易分辨，最低的檢測(cè)限度可達(dá)100.5TCID50，雖然該方法靈敏度高，但是結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性。張悅勇等[17]建立了豬偽狂犬病病毒納米PCR檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單，敏感度高，最低的檢出限為10 copies/μL，但是該方法不能對(duì)疫苗株和野毒株同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，也不能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)病原定量檢測(cè)，且納米材料不易獲得。蘭德松等[18]以PRVgB和gE基因?yàn)榘谢颍RV野毒株和gE基因缺失疫苗株的鑒別診斷和準(zhǔn)確定量的微滴式數(shù)字PCR方法，最低的檢測(cè)限度為2.3 copies/μL，但該方法操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員要求高，不適合基層檢測(cè)。吳鳳筍等[12]構(gòu)建了豬偽狂犬病病毒檢測(cè)基因芯片，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測(cè)的最低量可達(dá)1×10-6ng級(jí)，但由于該方法操作過(guò)程繁瑣且價(jià)格昂貴，限制了其推廣。此外，臨床上也使用ELISA方法通過(guò)對(duì)豬體內(nèi)gE抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，從而區(qū)分疫苗株和野毒株，但是抗體的產(chǎn)生具有滯后性，在免疫細(xì)胞呈遞抗原的這段時(shí)間抗體檢測(cè)幾乎沒(méi)有作用，對(duì)病毒的早期檢測(cè)不如實(shí)時(shí)熒光定量PCR及時(shí)。通過(guò)與以上研究對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，熒光實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)于其他的檢測(cè)方法來(lái)說(shuō)，操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏性好、價(jià)格便宜、時(shí)效性早，更加適用于臨床檢測(cè)。

綜上所述，本試驗(yàn)建立的TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，可同時(shí)檢測(cè)PRV野毒株和疫苗株，尤其是對(duì)PRV早期檢測(cè)更有效果，這將對(duì)臨床上PR的診斷與防控提供一種更加有效的解決方案。