甲基丙二酸血癥家系的基因診斷與產(chǎn)前診斷*

張菁菁,馬定遠,孫 云,洪冬洋,劉 剛,王玉國,曾華沙,胡 平,許爭峰

[南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)遺傳醫(yī)學中心,南京 210004]

甲基丙二酸血癥(methylmalonic acidemia,MMA)是一種常染色體隱性遺傳病，是目前中國最常見的有機酸尿癥[1]。MMA的發(fā)病率在不同地區(qū)有較大差異，亞太地區(qū)較低，為0.79/10萬，中東和北非地區(qū)可達6.04/10萬，國內各地發(fā)病率約為(1.5～2)/10萬[2]。MMA是由于特定的氨基酸(如異亮氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸等)、膽固醇和奇數(shù)鏈脂肪酸代謝障礙引起，由于上述代謝途徑中的甲基丙二酸輔酶A或其輔酶鈷胺素代謝缺陷導致體內甲基丙二酸的蓄積，從而對機體，特別是腦組織產(chǎn)生損傷，引起一系列多樣的臨床表現(xiàn)，嚴重時常危及患兒生命。根據(jù)是否合并同型半胱氨酸血癥，MMA可分為兩型：單純型甲基丙二酸血癥和甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥，在中國最常見的是合并型MMA[3]。

MMA患者發(fā)病年齡跨度較大，臨床表現(xiàn)多樣，首次就診時易誤診和漏診。隨著測序技術的快速發(fā)展，對MMA患者進行基因檢測有助于早期明確診斷和制定治療方案。研究表明，單純型MMA多由MUT(OMIM,609058)基因突變引起[4]，合并型MMA中最常見的是由MMACHC(OMIM,611935)基因突變引起的cblC型MMA，其它致病基因還有MMAA、MMAB、MMADHC及HCF1等[5-6]。通過測序技術檢測MMA相關基因，早期診斷MMA并對其家系進行產(chǎn)前診斷，對降低出生缺陷率有著較高的臨床價值。本研究收集了2016至2020年在南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學中心就診的35個MMA家系，對其進行基因檢測，在明確基因突變位點的前提下，對再次妊娠需要產(chǎn)前基因檢測的家系提供產(chǎn)前診斷。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2016年1月至2020年12月南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學中心共收集到35例MMA家系，其中30例為MMA合并高半胱氨酸血癥患兒家系，5例為單純型MMA患兒家系。所有患兒的新篩結果中丙酰基肉堿C3，C3/乙酰肉堿C2的比值，C3/游離肉堿C0的比值及尿氣相-質譜尿甲基丙二酸結果均超出正常范圍。30例合并型MMA患兒血清同型半胱氨酸升高。臨床診斷后建議患兒家庭進行基因檢測，對于再次妊娠后要求產(chǎn)前診斷的孕婦,采集羊水進行檢測。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有新生兒篩查、基因診斷及產(chǎn)前診斷工作均取得患兒家長同意并簽署知情同意書。

1.2 樣本收集與DNA提取 對35例患兒及其父母抽取2mL EDTA抗凝的外周血，需要產(chǎn)前診斷的孕婦再次妊娠18～22周，通過羊膜腔穿刺術抽取15mL羊水。采用DNA提取試劑盒(QIAamp，QIAGEN公司，德國)提取外周血或羊水基因組DNA，Nanodrop分光光度計(ThermoFisher，美國)測定DNA濃度，并且把DNA濃度稀釋在10～20ng/μL，OD260nm/280nm比值在1.8～2.0之間。

1.3 目標區(qū)域捕獲測序及生物信息學分析 目標區(qū)域捕獲測序是針對目的基因組區(qū)域涉及特異性的探針，將其與基因組DNA雜交，富集到目標基因組區(qū)域的DNA片段，再利用高通量測序技術進行測序的方法。本研究中將MMA疾病相關的基因MMUT、MCEE、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、LMBRD1、ABCD4、HCFC1、GPHN、PCCA以及PCCB基因的外顯子區(qū)域作為目標基因區(qū)域，應用捕獲芯片(MyGenostics,GenCap)對這些區(qū)域進行捕獲。具體步驟：首先將基因組DNA隨機打斷成片段，與Illumina PE接頭寡核苷酸混合物鏈接，對產(chǎn)物進行鏈接介導的聚合酶鏈式反應(LM-PCR)，將擴增純化后得到的DNA文庫與目標基因區(qū)域捕獲芯片進行雜交富集目標區(qū)域序列，通過Illumina Next500測序平臺對捕獲序列進行測序。將原始測序數(shù)據(jù)利用伯羅斯-惠勒比軟件(BWA,http://bio-bwa.sourceforge.net/)過濾，得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中人類基因組參考序列進行比對，利用基因組分析工具包軟件(GATK，https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出單核苷酸變異(SNV)和插入缺失突變的相關信息。然后通過ANNOVAR軟件(http://annovar.openbioinformati cs.org/en/latest/)對所有的SNP和插入缺失突變進行注釋。通過查閱文獻和以下數(shù)據(jù)庫對突變的致病性進行分析：正常人數(shù)據(jù)庫包括千人基因組計劃(http://www.1000genomes.or/)、Exome Variant Server(http://evs.gs.Washingto n.edu/EVS/)和EXAC(http://exac.broadinstitute.org/)。錯義突變使用SIFT(http://sift.jcvi.org/)，PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)和GERP++(http://mende l.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)。所有突變均經(jīng)過Sanger測序驗證。根據(jù)2015年ACMG遺傳變異分類標準和指南[7]，將突變分為致病性變異、可疑致病性變異、臨床意義不明變異以及良性變異。

1.4 產(chǎn)前診斷 對于患兒及父母明確基因型的家庭，再次妊娠至18～22周，抽取羊水進行相應突變位點的Sanger測序，并且采用21、18、13和性染色體倍型檢測試劑盒(上海晶準生物醫(yī)藥有限公司)進行STR分析以排除母體污染。

1.5 隨訪 對進行產(chǎn)前診斷的胎兒結局進行隨訪，對于足月分娩的新生兒進行常規(guī)足底血串聯(lián)質譜篩查，并且進行尿GC-MS檢測以及血中同型半胱氨酸檢測。

2 結 果

2.1 35例家系中基因突變分析 35例家系患兒中有5例患兒(5/35,14.3%)為MMUT基因突變所致，共包含9種MUT基因突變(表1)，分別為c.323G>A、c.470T>A、c.577A>T、c.693C>G、c.1280 G>A、c.1591delG、c.1610T>A、c.1663G>A以及c.2216_2219del。經(jīng)查閱文獻及軟件分析提示c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A以及c.2216_2219del是為新突變。5例家系分析均為復合雜合突變。

35例家系患兒中有30例患兒(30/35，85.7%)為MMACHC基因突變所致，共包含MMACHC基因突變12種(表2)，其中c.609G>A無義突變最常見，占40.3%，其次為c.658_660delAGG缺失突變，占21%，c.482G>A和c.80A>G分別占11.3%和8.1%，無義突變c.79C>T為首次報道的新突變。30例家系中3例為純合突變，其余均為復合雜合突變。

2.2 產(chǎn)前診斷結果 35例家系中有8對夫婦再次妊娠時接受產(chǎn)前基因檢測，首先對采集到的羊水樣本進行STR分析排除母血污染，保障基因檢測結果的可靠性，再對羊水樣本進行家系基因突變的檢測。結果提示，8個家系中有2例胎兒為野生型，1例胎兒為雜合突變攜帶者，5例胎兒基因型與先證者一致，這5個家系中有3個家庭第三次妊娠時羊水基因結果提示2例為野生型，1例為雜合變異攜帶者。對于基因檢測結果與先證者一致的胎兒均終止妊娠，其余野生型和雜合變異攜帶者均繼續(xù)妊娠(表3)。

表1 MUT基因突變匯總

表2 MMACHC基因突變匯總

表3 8例家系的產(chǎn)前診斷結果

2.3 隨訪結果 進行產(chǎn)前診斷的家系在胎兒出生后1月、6月、1年均進行隨訪，8個家系中經(jīng)1次或2次妊娠足月分娩的新生兒均接受新生兒足跟血篩查，結果均在正常范圍內，且1年隨訪生長發(fā)育均正常。

3 討 論

甲基丙二酸血癥是一種臨床表型多樣、癥狀嚴重的疾病[8]。近年來，各地區(qū)陸續(xù)報道了本地區(qū)范圍內的MMA臨床篩查和基因檢測結果，對該病的防治有著重要的臨床意義[9-12]。本研究總結近5年MMA病例的基因診斷和產(chǎn)前診斷結果，共收集35例MMA家系。通過基因檢測結果提示5例家系為單純型MMA，即MMUT基因突變所致；30例家系為cblC型MMA，即MMACHC基因突變所致，并且對8個家系再次妊娠時采集羊水行產(chǎn)前基因檢測。該研究為進一步明確本地區(qū)甲基丙二酸血癥的疾病譜和基因譜提供了參考依據(jù)，并且通過產(chǎn)前診斷可有效降低MMA患兒的出生率，減少出生缺陷率。

35例家系中，有30例均為MMACHC基因突變所致的cblC型MMA，占總病例數(shù)的85.7%(30/35)，這與以往文獻報道一致，即cblC型MMA是中國人群中最常見的類型[13]。MMACHC基因定位于1號染色體p34.1，共包含5個外顯子，其中外顯子1-4為編碼區(qū)，共編碼282個氨基酸，目前全世界范圍內報道的突變大約有一百余種，在白種人群中，c.271dupA為最常見的突變類型，而在中國人群中c.609G>A為cblC型MMA中最常見的突變[14]。Wang等[15]報道，在中國人群中，c.609G>A約占MMACHC基因所有突變的47.63%。于玥等[14]對攜帶c.609G>A突變的720例MMA患兒臨床及隨訪分析提示，攜帶該突變的患兒多為出生后1月內發(fā)病，且c.609G>A純合變異的患兒較攜帶c.609G>A與其它位點的復合雜合變異預后差。本研究中，30例cblC型MMA中共發(fā)現(xiàn)12種突變，c.609G>A為最常見類型，約占40.3%，與已報道的文獻一致。本研究的突變中，還發(fā)現(xiàn)一種新的無義突變c.79C>T，該變異導致氨基酸序列發(fā)生p.Gln27Ter突變，該突變在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(human gene mutation database,HGMD)無記載，但由于該突變使MMACHC基因的編碼信息發(fā)生錯誤，可使編碼的蛋白質提前終止，從而導致表達截短形式的蛋白質。此外，查閱正常人群數(shù)據(jù)庫，該變異位點均無記載，評估為罕見變異，該患兒的另一個突變位點為MMACHC基因的經(jīng)典突變位點c.609G>A，評估其為致病性突變，綜合評估c.79C>T新變異為致病性變異。

本研究病例中，除最常見的MMACHC基因所致的cblC型MMA外，5例均為MUT基因突變所致的單純型MMA。MUT基因定位于6號染色體p12.3，共有13個外顯子，編碼750個氨基酸。目前全世界范圍內已報道的突變類型有近300種，大多數(shù)突變僅在一個家系中發(fā)現(xiàn)，所以沒有明確的熱點突變類型[2]。以往研究報道中，在我國較常見的突變位點是c.729_730insTT、c.323G>A以及c.1106G>A，但還需積累更多病例和基因突變信息，確定MUT基因的突變熱點[16]。本研究中5個家系共包含9種基因突變類型，其中有4種為新突變：c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A以及c.2216_2219del。對這些新突變進行了致病性評估：(1)c.1591delG為移碼突變，可導致氨基酸序列發(fā)生p.Glu531 Asnfs*7改變，可使編碼的蛋白質提前終止，從而導致表達截短形式的蛋白質，從而影響蛋白功能，在正常人群數(shù)據(jù)庫中記載頻率極低，屬于罕見變異。且該患兒另一個突變位點為明確致病位點，綜合評估該變異為致病性突變。(2)c.1610T>A為錯義突變，可導致氨基酸p.Leu537Gln改變，在正常人群數(shù)據(jù)庫中均無頻率記載或頻率極低，評估屬于罕見變異。攜帶c.1610T>A的患兒另一個突變位點為明確致病變異，且患兒臨床表現(xiàn)及血檢指標均符合MMA診斷，評估c.1610T>A為可能致病變異。(3)c.577A>T為錯義突變，可導致氨基酸p.Ile193Phe改變，在正常人群數(shù)據(jù)庫中無頻率記載，屬于罕見變異，攜帶c.577T>A的患兒另一個突變也為新發(fā)變異(c.2216_2219del)，所以評估該變異為臨床意義不明的變異。(4)c.2216_2219del為移碼變異，可導致氨基酸序列發(fā)生p.Ile739Argfs*18改變，但該變異位于MMUT基因最后一個外顯子，導致甲基丙二酰輔酶A變位酶最后12個氨基酸發(fā)生變化，并多延伸5個氨基酸，評估該變異不導致無義介導的mRNA降解，關于該變異是否在蛋白質水平上影響功能未見研究報道，評估該變異為臨床意義不明的變異。因此，c.557A>T和c.2216_2219del的致病性還有待進一步的數(shù)據(jù)及功能實驗證實。

串聯(lián)質譜應用于新生兒遺傳代謝病的篩查以及基因診斷MMA的普及以來[17]，MMA患兒能做到早診斷、早治療[18]，但一些患兒治療后仍遺留一定的智力或運動障礙，對家庭和社會帶來一定的經(jīng)濟和精神負擔。因此，孕期的產(chǎn)前診斷顯得尤為重要[19]。本研究對明確基因位點的8個家系再次妊娠時采集羊水進行產(chǎn)前基因診斷，有效阻斷MMA患兒的出生，對產(chǎn)前基因檢測陰性，正常分娩胎兒的隨訪各項指標均在正常范圍內。

本研究總結了近5年MMA患兒的基因檢測結果，不僅發(fā)現(xiàn)了本地區(qū)MMACHC基因的熱點突變，并且檢測到MMACHC和MUT基因共5種新突變，豐富了MMA患兒的基因突變譜。通過分析，一些新突變被證實為致病或可能致病變異，但有些新突變的致病性還有待更多的病例和功能實驗的證實。對已確定基因型的家系提供產(chǎn)前診斷，對避免MMA患兒的出生，降低出生缺陷率有著重要的臨床意義。