THSD4基因在小鼠間充質(zhì)干細胞及MC3T3-E1細胞成骨分化中的作用

王典開 蔣雷生,2*

1. 上海交通大學醫(yī)學院，上海 200092 2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院脊柱中心，上海 200092

骨形成和骨吸收之間的動態(tài)平衡是維持骨穩(wěn)態(tài)的主要機制，該機制由破骨細胞和成骨細胞緊密結(jié)合、協(xié)調(diào)，維持著骨骼的最佳骨量[1]。成骨細胞分化和骨形成在維持骨重建平衡和骨量中起著關鍵作用，成骨細胞來源于間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)，間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能，可以分化為成纖維細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞等[2]。成骨細胞可以合成和分泌骨代謝所需的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨保護素(osteoprotegerin, OPG) 等20多種蛋白質(zhì)和調(diào)節(jié)因子，以及促進細胞外礦化結(jié)節(jié)的形成[3]。

I型血小板反應蛋白4 (thrombospondin, type I, domain containing 4，THSD4)基因編碼I型血小板反應蛋白，它與血小板反應蛋白基因家族的其他成員具有同源性。THSD家族成員已被證實在傷口愈合、炎癥和血管生成中發(fā)揮重要作用[4]。研究[5-6]發(fā)現(xiàn),糖皮質(zhì)激素會增加THSD1和THSD2 mRNA的表達水平,從而負性調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松。

然而，THSD4對成骨細胞分化的影響尚未見報道。本研究旨在探討骨質(zhì)疏松癥患者間充質(zhì)干細胞中THSD4基因表達的變化，明確 THSD4基因?qū)π∈箝g充質(zhì)干細胞以及MC3T3-E1細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)、胎牛血清(Hyclone，美國)、青/鏈霉素溶液(Gibco，美國)、0.25 %胰蛋白酶(Gibco，美國，貨號：25200-056)、二甲基亞砜(DMSO)、L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、地塞米松、BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天，上海，貨號：C3206)、茜素紅S染色液(0.1 % pH 4.2)、Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen，上海，貨號：11202ES08*)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，上海，貨號：P0010 S )、PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(Takara,日本，貨號：RR036A)、Trizol及總RNA提取試劑盒(Invitrogen，美國)、RIPA裂解液(碧云天，上海，貨號：P0013C)、苯甲基磺酰氟(碧云天，上海，貨號：ST506)、細胞培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)、生物安全柜(力申科學儀器有限公司，上海)、熒光定量PCR儀(Roche LightCycler 480,德國),THSD4抗體(Proteintech, 美國，貨號：20619-1-AP)，β-actin (碧云天，上海，貨號：AA128)等。

1.2 方法

1.2.1人骨髓間充質(zhì)干細胞的提?。韩@得患者本人知情同意并簽署同意書，本研究通過股骨頭置換術采集骨髓血，收集了3例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者和3例退變性骨關節(jié)炎患者的骨髓標本。通過Percoll密度梯度離心法，從骨髓液中分離含有骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞層，通過Trizol試劑盒提取骨髓間充質(zhì)干細胞的RNA，并送二代測序檢測。將骨關節(jié)炎患者視為對照組，骨質(zhì)疏松癥患者視為實驗組[7-8]。本研究已經(jīng)通過上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批(批件號：XHEC-NSFC-2020-303)。

1.2.2基因測序：通過轉(zhuǎn)錄組測序方法測定骨髓間充質(zhì)干細胞的基因表達水平。在提取人骨髓間充質(zhì)干細胞后，用Trizol提取細胞總RNA,然后使用Qiagen的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄。所得的cDNA送華大公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。通過R語言Limma包對間充質(zhì)干細胞測序結(jié)果進行差異分析并繪制差異分析的火山圖及熱圖。對差異分析結(jié)果進行KEGG富集分析、GO富集分析以及GSEA富集分析，探究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者與退變性骨關節(jié)炎患者的骨髓間充質(zhì)干細胞中mRNA的表達差異。

1.2.3細胞培養(yǎng)及誘導成骨分化：小鼠MC3T3-E1細胞系購自中國科學院細胞庫。細胞在37 ℃且含5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。MC3T3-E1細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，該培養(yǎng)基內(nèi)含有體積分數(shù)10 %的胎牛血清、青霉素(100 U/mL)、鏈霉素(100 U/mL)。成骨培養(yǎng)基(1%胎牛血清、50 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和0.1 μmol/L地塞米松)用于誘導成骨細胞分化。培養(yǎng)基每3天更換一次。小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞以及MC3T3-E1細胞以5 000個/cm2的密度接種于6孔板中，每組設有3個重復孔。每組實驗至少進行了3次獨立重復實驗，且兩組細胞的誘導分化方法和操作均保持一致。

1.2.4分離傳代骨髓間充質(zhì)干細胞：使用4周齡的C57BL/6雌性小鼠來提取小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。小鼠由上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院動物實驗中心提供，共15只，體質(zhì)量(20±3)g，保持室溫(25±1)℃，相對濕度50 %～60 %，自由飼養(yǎng)和飲水。將小鼠麻醉后處死，于75 %乙醇中浸泡20 min。在無菌條件下仔細分離并取出小鼠雙側(cè)股骨，使用無菌剪刀剪斷股骨兩端，用DMEM培養(yǎng)基從股骨中沖洗出骨髓細胞。用40 μm濾網(wǎng)過濾組織團塊后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，按每孔3×104個細胞的密度接種于6孔板內(nèi)。用含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5 % CO2的培養(yǎng)箱中并每3天換液一次。一周后貼壁細胞被認為是小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，形態(tài)表現(xiàn)為梭形或多角形。培養(yǎng)10 d左右，細胞融合率可達到80 %～90 %，開始傳代。用0.25 %胰蛋白酶消化貼壁的BMSCs，按1∶2的比例進行傳代，取之后的3～4代BMSCs用于研究實驗。誘導7 d后收集細胞進行堿性磷酸酶染色，誘導21 d后進行茜紅素染色。

1.2.5RNA提取及qRT-PCR：根據(jù)Trizol及總RNA提取試劑盒(Invitrogen)說明書提取細胞總RNA：Trizol裂解貼壁細胞，將上清液移至EP管中，通過氯仿及異丙醇提取RNA，75 %乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后加DEPC水溶解RNA，使用分光光度計檢測RNA濃度，取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara)說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(Yeasen)進行PCR檢測相應mRNA的表達水平,具體PCR引物詳見表1。

表1 PCR引物序列Table.1 Primers Sequence

1.2.6茜素紅染色：培養(yǎng)21 d后，進行茜素紅染色分析以評估細胞礦化能力。PBS清洗MC3T3-E1及M-BMSC細胞2遍后，均以2×104個/mL的密度接種于24孔板內(nèi)，每孔加4 %多聚甲醛固定30 min。用PBS洗滌三次后，細胞在室溫下用茜素紅S染色液(0.1 %, pH 4.2)孵育10 min。用PBS洗滌三次后，顯微鏡下觀察細胞鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量以及著色深淺度。

1.2.7堿性磷酸酶染色：根據(jù)BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天)說明書進行堿性磷酸酶染色。MC3T3-E1細胞或M-BMSCs以PBS洗滌3次后，用4 %多聚甲醛固定20 min。配制BCIP/NBT染色工作液并進行堿性磷酸酶染色。染色2 h后用蒸餾水洗滌細胞，并在顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.8Western Blot分析：用含1 %蛋白酶抑制劑及1 %磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液提取細胞總蛋白。細胞用PBS洗滌3次，每孔加入100 μL的RIPA細胞裂解液，收集裂解液以12 000 r/min，離心半徑10 cm，4 ℃，離心15 min，取上清液。采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。通過蛋白電泳將樣品中等量(20 μg)的蛋白質(zhì)在12 % SDS-PAGE上分離，并電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5 %無脂奶粉在室溫下封閉膜2 h。一抗孵育過夜，TBST洗滌三次后PVDF膜與二抗在室溫下孵育1 h。TBST洗滌三次后(每次洗滌15 min)，用增強化學發(fā)光試劑(美國Amersham Biosciences)進行蛋白印跡檢測，使用β-actin用作內(nèi)參對照。

1.2.9構建慢病毒載體：構建慢病毒載體由吉滿生物有限公司(上海)完成，過表達/敲減慢病毒通過四質(zhì)粒法完成，其中轉(zhuǎn)移質(zhì)粒采用PGLMV質(zhì)粒載體。根據(jù)THSD4基因CDS區(qū)構建其過表達質(zhì)粒，敲減質(zhì)粒的干擾序列為：1. CCTGGGATCT GACAAAGTCTT；2.GGACAATGTTCACCTACAAAC；3. GGCCAAATGACATCGAGAACT。轉(zhuǎn)染前細胞以4×105/孔鋪至6孔板中，加入慢病毒懸液及polybrene以輔助轉(zhuǎn)染。37 ℃孵育。24 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染3 d后加入嘌呤霉素以篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。慢病毒過表達及敲減效率均通過PCR及Western Blot驗證。

1.2.10siRNA轉(zhuǎn)染：在骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化前轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前24 h將骨髓間充質(zhì)干細胞接種于6孔板內(nèi)，待細胞生長至70 %時開始進行轉(zhuǎn)染。用OPTI分別稀釋siRNA及RFECT，室溫靜置5 min?；靹蚝笫覝胤跤?0 min，待形成siRNA-脂質(zhì)體混合物，在無血清條件下將混合物轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染6 h后，加入FBS，使血清濃度達到10 %，繼續(xù)培養(yǎng)。于不同時間點測量THSD4基因和相關蛋白質(zhì)的表達量。實驗重復檢測3次。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 骨質(zhì)疏松癥及骨關節(jié)炎患者骨髓間充質(zhì)干細胞基因測序及分析結(jié)果

通過提取骨質(zhì)疏松癥患者及骨關節(jié)炎患者的骨髓間充質(zhì)干細胞，檢測在兩組患者間充質(zhì)干細胞中基因表達的差異。使用Limma包對測序結(jié)果進行差異分析，在骨質(zhì)疏松癥組中發(fā)現(xiàn)了16個明顯上調(diào)的基因(包括HEY2、CNTN3、KAL1、DOK6等)和29個明顯下調(diào)的基因(包括THSD4、SPIC、MYF6、VASP、GIPR等)(與骨關節(jié)炎患者相對比)。其中THSD4在所有下調(diào)基因中差異性最明顯，且進一步通過PCR檢測以及Western-blot檢測THSD4基因相關mRNA、蛋白質(zhì)，均發(fā)現(xiàn)在骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細胞中THSD4基因相關mRNA、蛋白質(zhì)均明顯下調(diào)。因此選擇THSD4作為本研究的目標基因。通過KEGG以及GO富集分析發(fā)現(xiàn)PI3K-AKT信號通路及Wnt信號通路在兩組患者的間充質(zhì)干細胞中變化明顯，這提示了此兩條通路可能與THSD4的功能相關。見圖1。

2.2 THSD4 在成骨分化過程中表達量增加

為了探究在成骨分化過程中THSD4表達量的變化，本研究通過提取不同分化階段的成骨細胞的mRNA來檢測THSD4 以及成骨分化的標志性基因(ALP、Runx2、Osx)的表達水平。PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著成骨誘導分化時間的延長，THSD 4 mRNA、ALP mRNA、Runx2 mRNA、Osx mRNA在MC3T3-E1以及M-BMSC細胞中表達量均逐漸增加，均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 成骨細胞分化過程中THSD4表達量增加Fig.2 The expression level of THSD4 Increased during osteoblast differentiation注：A：PCR檢測MC3T3-E1細胞成骨分化過程中THSD4 mRNA的表達變化；B：PCR檢測MC3T3-E1細胞成骨分化過程中ALP、Runx2及Osx mRNA的表達變化；C：PCR檢測小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中THSD4 mRNA的表達變化；D：PCR檢測小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中ALP、Runx2及Osx mRNA的表達變化。***P<0.001。

2.3 THSD4 可以增強MC3T3-E1細胞成骨分化能力

本研究通過構建慢病毒表達載體來實現(xiàn)對小鼠MC3T3-E1細胞中THSD4的敲減及過表達。通過PCR以及Western blot驗證THSD4的敲減及過表達效率。筆者發(fā)現(xiàn)，抑制THSD4 可以下調(diào)成骨分化相關基因(ALP、Runx2、Osx)的表達水平。而過表達THSD4 則可以促進ALP、Runx2、Osx的表達。通過堿性磷酸酶染色及茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，THSD4可以增強MC3T3-E1細胞的成骨分化能力。見圖3。

圖3 THSD4促進了MC3T3-E1細胞的成骨分化能力Fig.3 THSD4 promoted the osteogenic differentiation capacity of MC3T3-E1 cells注：A：PCR檢測MC3T3-E1細胞中THSD4 mRNA慢病毒敲減及過表達效率；B：Western Blot檢測MC3T3-E1細胞中THSD4蛋白表達；C：檢測THSD4 基因敲減及過表達前后MC3T3-E1細胞中ALP、Runx2及Osx mRNA的表達變化；D：堿性磷酸酶及茜素紅染色檢測THSD4 基因敲減及過表達前后MC3T3-E1細胞的成骨分化能力。***P<0.001。

2.4 THSD4可以增強M-BMSC成骨分化能力

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THSD4 與M-BMSC細胞內(nèi)成骨分化相關基因呈正相關：抑制THSD4可以下調(diào)M-BMSC中ALP、Runx2、Osx的表達水平，而過表達THSD4則可以提高ALP、Runx2、Osx的表達水平。通過堿性磷酸酶染色及茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，THSD4可以增強小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力。見圖4。

圖4 THSD4增強了M-BMSCs的成骨分化能力Fig.4 THSD4 enhanced the osteogenic differentiation capacity of M-BMSCs注：A：檢測THSD4 基因敲減及過表達前后小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中ALP、Runx2及Osx mRNA的表達變化；B：堿性磷酸酶及茜素紅染色檢測THSD4基因敲減及過表達前后小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化能力。**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

THSD4基因作為THSD家族成員之一，其編碼的I型血小板反應蛋白與其他類型的血小板反應蛋白在傷口愈合、炎癥和血管生成中發(fā)揮了重要的作用[4]。有研究[9]證實，糖皮質(zhì)激素導致的骨質(zhì)疏松癥患者中血小板反應蛋白mRNA水平升高,而血小板反應蛋白的增高可以進一步負反饋調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨量變化，從而緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生，因此，血小板反應蛋白可能在骨代謝中發(fā)揮重要作用。THSD家族中THSD1基因已被證明可以結(jié)合并激活轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)，而骨基質(zhì)中的TGF-β是成骨細胞增殖和分化的重要調(diào)節(jié)因子[10]。研究[11]表明，THSD4基因可參與編碼微纖維結(jié)合蛋白ADAMTSL6(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs like 6)，ADAMTSL6是ADAMTSL蛋白之一，是ADAMTS超家族的一個亞群，ADAMTSL蛋白的突變可以導致骨發(fā)育不良，提示ADAMTSL蛋白在人類骨代謝中可能扮演重要角色[12]。此前，在日本進行的一項包含337名研究對象的實驗中發(fā)現(xiàn)，THSD4基因的DNA多態(tài)性與腰椎和股骨骨密度存在很大相關性[13]。因此，筆者認為THSD4基因可能在骨代謝過程中扮演重要角色，然而，THSD4對骨代謝的具體關系及其作用效果尚無報道。

本研究結(jié)果表明，通過基因測序發(fā)現(xiàn)THSD4基因在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細胞所有下調(diào)的基因中差異性最為明顯，且通過KEGG以及GO富集分析發(fā)現(xiàn)，THSD4基因可能通過PI3K-AKT信號通路及Wnt信號通路影響骨代謝。通過對人骨髓間充質(zhì)干細胞不同分化階段的mRNA檢測，THSD4基因在成骨分化過程中，表達量逐漸增加，且伴隨著THSD4水平的升高，成骨分化的標志性基因(ALP、Runx2、Osx)的表達水平也同步增加。通過對MC3T3-E1細胞以及小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞中THSD4基因的敲減及過表達，筆者發(fā)現(xiàn)，抑制THSD4基因可以下調(diào)成骨分化相關基因(ALP、Runx2、Osx)的表達水平和成骨分化能力，而過表達THSD4基因則可以促進ALP、Runx2、Osx的表達、增強成骨分化能力。但是，本研究雖然明確了THSD4基因?qū)π∈箝g充質(zhì)干細胞成骨分化能力的影響，但并未明確該基因?qū)θ顺晒欠只淖饔?；此外，筆者發(fā)現(xiàn)THSD4基因可能通過PI3K-AKT信號通路及Wnt信號通路影響人體骨代謝，但仍需通過進一步實驗加以證實和明確。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實了THSD4基因在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細胞中下調(diào)，THSD4具有可以促進MC3T3-E1細胞以及小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的能力。