子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中PD-L2的表達(dá)及臨床意義

繆小兵，張邢松，沈 蓉，朱興華，賈美群

子宮頸癌是常見的婦科腫瘤，通常由持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒引起。子宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma, CSCC)和子宮頸腺癌(cervical adenocarcinoma, CAC)是子宮頸癌最常見的組織學(xué)亞型，兩者在致癌突變、免疫微環(huán)境、治療反應(yīng)和預(yù)后等均存在差異[1]。近年，靶向程序性死亡受體-1(programmed death-1, PD-1)/程序性死亡配體-1 (programmed death-ligand 1, PD-L1)通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，在腫瘤的免疫治療中備受關(guān)注[2]。PD-L1通過與活化T細(xì)胞表面的PD-1結(jié)合，抑制免疫反應(yīng)。程序性死亡配體-2(programmed death-ligand 2, PD-L2)是PD-1的另一個(gè)配體，主要存在于活化的樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[3]。目前，PD-L1在子宮頸癌中的表達(dá)及作用已有較多報(bào)道，但對(duì)PD-L2仍知之甚少。本文著重探討CSCC及CAC中腫瘤細(xì)胞以及腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞(tumor-infiltrating immune cell, TIIC)PD-L2的表達(dá)及臨床意義，為子宮頸癌的免疫治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2007年12月～2014年8月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院病理科確診的子宮頸癌石蠟標(biāo)本161例，其中144例CSCC、17例CAC，并制作成組織芯片?；颊吣挲g29～79歲，中位年齡52歲。入選病例均為手術(shù)標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放、化療。

1.2 免疫組化PD-L2一抗(D7U8C，1 ∶200稀釋)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，二抗及DAB購(gòu)自DAKO公司。免疫組化染色采用EnVision法，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)PD-L2陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)。參考Okadome等[4]的標(biāo)準(zhǔn)，腫瘤細(xì)胞 PD-L2判讀按陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分；(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分：<10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分。將兩者得分相乘作為總評(píng)分：≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性。TIIC PD-L2判讀按陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行判讀：陽(yáng)性細(xì)胞比例≥5%為陽(yáng)性，<5%為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Pearson χ2、Fisher精確概率法分析腫瘤細(xì)胞、TICC PD-L2的表達(dá)及與CSCC臨床病理特征的關(guān)系。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用Log-rank檢驗(yàn)。采用Cox風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型進(jìn)行單因素和多因素預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌中PD-L2的表達(dá)本組161例子宮頸癌組織中129例CSCC、14例CAC進(jìn)行PD-L2檢測(cè)；另18例因點(diǎn)陣脫落無(wú)法進(jìn)行判讀，包括15例CSCC、3例CAC。腫瘤細(xì)胞PD-L2的總陽(yáng)性率為16.8%(24/143)，TIIC PD-L2的總陽(yáng)性率為66.4%(95/143)。腫瘤細(xì)胞 PD-L2在CSCC中的陽(yáng)性率為16.3%(21/129)，TIIC PD-L2在CSCC中的陽(yáng)性率為65.1%(84/129)(圖1、2)。腫瘤細(xì)胞 PD-L2在CAC中的陽(yáng)性率為21.4%(3/14)，TIIC PD-L2在CAC中的陽(yáng)性率為78.6%(11/14)(表1，圖3、4)。

表1 CSCC及CAC中腫瘤細(xì)胞及TIIC PD-L2的表達(dá)[n(%)]

2.2 CSCC中PD-L2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，其在浸潤(rùn)深度<1/3纖維肌層(8.2%，5/61)患者中的表達(dá)低于浸潤(rùn)深度達(dá)1/3～2/3層(20.7%，6/29)以及>2/3層(25.6%，10/39)患者中的表達(dá)(P=0.040)；腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、腫瘤分化、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達(dá)與腫瘤分化相關(guān)，其在高+中分化腫瘤(75.0%，42/56)中的表達(dá)高于低分化腫瘤(57.5%，42/73)(P=0.039)；TIIC PD-L2表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、浸潤(rùn)深度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期均無(wú)關(guān)(P均>0.05，表2)。

圖1 CSCC中腫瘤細(xì)胞PD-L2呈陽(yáng)性，EnVision法 圖2 CSCC中腫瘤細(xì)胞PD-L2呈陰性，TIIC PD-L2呈陽(yáng)性，EnVision法 圖3 CAC中腫瘤細(xì)胞及TIIC PD-L2均呈陽(yáng)性，EnVision法 圖4 CAC中腫瘤細(xì)胞 PD-L2呈陰性，EnVision法

2.3 PD-L2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系129例CSCC中有完整隨訪資料111例，中位隨訪時(shí)間110個(gè)月(12～163個(gè)月)，其中18例患者出現(xiàn)疾病進(jìn)展，16例患者死亡。Kaplan-Meier生存分析顯示：腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與患者無(wú)瘤生存期(disease free survival, DFS)和總生存期(overall survival, OS)均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。TIIC PD-L2陽(yáng)性患者比PD-L2陰性患者的DFS(P=0.007 2)和OS(P=0.011 9)長(zhǎng)(圖5)。Cox單因素回歸分析顯示：浸潤(rùn)深度(P=0.012)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)、FIGO分期(P=0.002)以及TIIC PD-L2表達(dá)(P=0.011)與DFS相關(guān)；脈管侵犯(P=0.039)、浸潤(rùn)深度(P=0.003)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.001)、FIGO分期(P=0.001)以及TIIC PD-L2表達(dá)(P=0.018)與OS相關(guān)。Cox多因素分析顯示：FIGO分期(P=0.042)是影響DFS的獨(dú)立預(yù)后因素；浸潤(rùn)深度(P=0.021)、FIGO分期(P=0.027)是影響OS的獨(dú)立預(yù)后因素。TIIC PD-L2是影響DFS和OS的相關(guān)因素，但不是獨(dú)立的預(yù)后因素(P均>0.05，表3)。

表2 CSCC腫瘤細(xì)胞及TIIC PD-L2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

表3 Cox單因素和多因素回歸模型分析CSCC患者DFS和OS

3 討論

PD-1又稱為PDCD1、CD279，屬于免疫球蛋白B7-CD28家族成員，在多種免疫細(xì)胞(主要是T淋巴細(xì)胞)發(fā)現(xiàn)的抑制性受體[5-6]。PD-L1是PD-1的第一配體，由9號(hào)染色體上的Cd274基因編碼，在免疫反應(yīng)中起負(fù)性調(diào)控作用。PD-L1通過抑制T細(xì)胞的免疫活性，逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[7]。PD-L2又稱為CD273、B7-DC，也是抑制T細(xì)胞活化的免疫檢查點(diǎn)通路的關(guān)鍵分子。PD-L2是一種I型跨膜蛋白，在其細(xì)胞外區(qū)域包含免疫球蛋白可變(immunoglobulin variable, IgV)樣結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白恒定 (immunoglobulin constant, IgC) 樣結(jié)構(gòu)域。PD-L2主要表達(dá)于抗原呈遞細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和髓樣樹突狀細(xì)胞，還可表達(dá)于非造血組織，如肺、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞[8]。此外，PD-L2還可表達(dá)于多種類型的腫瘤細(xì)胞[9]。

圖5 CSCC中腫瘤細(xì)胞及TIIC PD-L2表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線：A.腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與DFS的關(guān)系；B.腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與OS的關(guān)系；C.TIIC PD-L2表達(dá)與DFS的關(guān)系；D.TIIC PD-L2表達(dá)與OS的關(guān)系

PD-L1和PD-L2可表達(dá)于多種不同的腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境細(xì)胞，包括TIIC。Rotman等[1]檢測(cè)59例子宮頸癌(43例CSCC、14例CAC、2例腺鱗狀細(xì)胞癌)中PD-L2的表達(dá)，結(jié)果顯示：腫瘤細(xì)胞PD-L2在子宮頸癌中的總陽(yáng)性率為53%(31/59)，其中CSCC陽(yáng)性29例，CAC陽(yáng)性1例，腺鱗狀細(xì)胞癌陽(yáng)性1例；TIIC PD-L2在子宮頸癌中的總陽(yáng)性率為39%(23/59)，其中CSCC陽(yáng)性21例，CAC陽(yáng)性1例，腺鱗狀細(xì)胞癌陽(yáng)性1例。本組發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞PD-L2的總陽(yáng)性率為16.8%(24/143)，TIIC PD-L2的總陽(yáng)性率為66.4%(95/143)。腫瘤細(xì)胞PD-L2在CSCC中陽(yáng)性率為16.3%(21/129)，TIIC PD-L2在CSCC中陽(yáng)性率為65.1%(84/129)。此外，本組結(jié)果還顯示腫瘤細(xì)胞PD-L2在CAC中的陽(yáng)性率為21.4%(3/14)，TIIC PD-L2在CAC中的陽(yáng)性率為78.6%(11/14)，高于文獻(xiàn)報(bào)道；其可能與本組采用組織芯片(由于腫瘤異質(zhì)性，組織芯片不能代表組織切片全貌)有關(guān)。本組CSCC中腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與CSCC腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，其在浸潤(rùn)深度<1/3纖維肌層患者中的表達(dá)顯著低于浸潤(rùn)深度達(dá)1/3～2/3纖維肌層以及>2/3纖維肌層患者(P=0.040)；腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、腫瘤分化、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達(dá)與CSCC腫瘤分化相關(guān)，其在高+中分化腫瘤中的表達(dá)顯著高于低分化腫瘤(P=0.039)；TIIC PD-L2表達(dá)與患者年齡、脈管侵犯、浸潤(rùn)深度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及FIGO分期均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。

目前，PD-L1和PD-L2在腫瘤中的預(yù)后價(jià)值仍有爭(zhēng)議。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與某些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)，而TIIC PD-L1表達(dá)與OS延長(zhǎng)相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道子宮頸癌中腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)與OS無(wú)關(guān)，而TIIC PD-L1陽(yáng)性原發(fā)性腫瘤患者的OS比PD-L1陰性患者顯著延長(zhǎng)[8,10-12]。目前，關(guān)于PD-L2對(duì)子宮頸癌預(yù)后影響的報(bào)道較少。本組發(fā)現(xiàn)：腫瘤細(xì)胞 PD-L2表達(dá)與CSCC患者的DFS和OS均無(wú)關(guān)(P均>0.05)。TIIC PD-L2陽(yáng)性患者比PD-L2陰性患者的DFS(P=0.007 2)和OS(P=0.011 9)延長(zhǎng)。Cox多因素回歸分析顯示：TIIC PD-L2是影響CSCC患者DFS和OS的相關(guān)因素，但不是獨(dú)立的預(yù)后因素。

綜上所述，CSCC中腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)，在浸潤(rùn)深度局限于淺1/3纖維肌層患者中的表達(dá)相對(duì)較低；TIIC PD-L2表達(dá)與腫瘤分化相關(guān)，在高+中分化CSCC中的表達(dá)高于低分化CSCC。腫瘤細(xì)胞PD-L2表達(dá)與CSCC患者的DFS和OS均無(wú)關(guān)；但CSCC中TIIC PD-L2陽(yáng)性患者比PD-L2陰性患者的DFS和OS延長(zhǎng)。因此，檢測(cè)PD-L2表達(dá)狀態(tài)可為子宮頸癌的免疫治療提供參考。