子宮內(nèi)膜癌中LRP16的表達(dá)及臨床病理分析

朱 清，唐明洋，黃園莉，張光輝，趙 艷

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其主要發(fā)病原因可能與長(zhǎng)期的雌激素刺激有關(guān)[1-2]，而與雌激素關(guān)系緊密的白血病相關(guān)蛋白LRP16是從健康成人外周血淋巴細(xì)胞中克隆的基因，該基因在人類(lèi)多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且與雌二醇的調(diào)控有關(guān)[3-4]。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)是可以克隆到表達(dá)載體并表達(dá)短的干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)的DNA分子，可根據(jù)靶向基因LRP16設(shè)計(jì)shRNA序列，并將其克隆到特定載體上[5]。本文旨在探討LRP16在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系；通過(guò)RNA干擾下調(diào)人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株(Ishikawa, ISK)中LRP16基因的表達(dá)，分析其對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2016年12月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的子宮內(nèi)膜癌組織160例，術(shù)后經(jīng)常規(guī)病理組織檢查證實(shí)均為雌激素依賴(lài)型(即子宮內(nèi)膜樣癌)；另選取60例正常子宮內(nèi)膜組織(為子宮內(nèi)膜活檢或其他良性疾病中獲取)作對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 細(xì)胞株及主要試劑人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株ISK、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒，購(gòu)自上海吉瑪公司。LRP16-shRNA表達(dá)載體(Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-149046-SH)；DMEM(高)培養(yǎng)液、胎牛血清(Hyclone)、PBS平衡液；LRP16抗體(Abcam公司、ab122688)；β-actin抗體(Abcam公司、ab8229)。Lipofectamine 2000、Trizol試劑，購(gòu)自Invitrogen公司。CCK-8試劑、Transwell小室，購(gòu)自上海碧云天公司。結(jié)合基質(zhì)膠Matrigel購(gòu)自BD公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，連續(xù)4 μm厚切片，脫蠟，免疫組化采用EliVision染色。切片在檸檬酸鹽溶液中121 ℃ 3 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后在3%H2O2溶液中靜置10 min，添加一抗LRP16兔抗人60 ℃ 1 h，PBS沖洗3次×3 min，二抗37 ℃ 30 min，PBS沖洗后DAB顯色，蘇木精復(fù)染后經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固，鏡下觀察。結(jié)果以胞質(zhì)或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)，對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行綜合評(píng)分[6]。使用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行圖像分析，以累積光密度(integrated optical density， IOD)/面積值判斷LRP16蛋白的表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ISK細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。每2～3天傳代1次。傳代時(shí)先棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌2～3次，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入培養(yǎng)基吹打細(xì)胞，重置細(xì)胞液接種于培養(yǎng)瓶。實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.3.3shRNA干擾載體構(gòu)建 shRNA序列：siLRP16組：5′-GATCCCGCAGCGGGAGGAACATTACT TCAAGAGAGTAATGTTCCTCCCGCTGCTTTTTTGGAA A-3′；對(duì)照組：5′-AGCTTTTCCAAAAAAGCAGCGG GAGGAACATTACTCTCTTGAAGTAATGTTCCTCCCGC TGCGG-3′。

1.3.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將ISK細(xì)胞按3×105個(gè)/孔接種于6孔板，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)按Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，孵育48 h，將siLRP16(50 nmol/L)轉(zhuǎn)染入ISK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染4 h后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染siLRP16)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染無(wú)序RNA)、空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染)。

1.3.5Western blot法 轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞提取的蛋白，經(jīng)10%聚丙烯胺凝膠分離。制備分離膠和積層膠，每孔加入等量蛋白樣本電泳和封閉。將膜置于一抗(LRP16稀釋比為1 ∶200；β-actin稀釋比為1 ∶500)中，振蕩2 h后放置4 ℃冰箱過(guò)夜；放入TBST溶液中洗膜3次×10 min，在二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，稀釋比為1 ∶2 000)中溫和振蕩2 h，置于TBST溶液中洗膜3次×10 min。加入化學(xué)發(fā)光底物A+B，用凝膠成像儀掃描入計(jì)算機(jī)，結(jié)果用Quantity One軟件分析，以LRP16蛋白與β-actin蛋白條帶平均值的比值表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6RT-PCR 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)定量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取5 μg總RNA進(jìn)行。LRP16基因引物序列：上游5′-CCGCAGCGACATCACCAAGC-3′，下游5′-TCCGGCACTCGTCGGTAAGC-3′；β-actin引物序列：上游5′-AAAGACCTGTACGCCAACAC-3′，下游5′-GTCATACTCCTGCTTGCTGAT-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳30 min，在紫外燈下觀察DNA條帶，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行拍照、灰度值分析。

1.3.7CCK-8實(shí)驗(yàn) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升5×104個(gè)細(xì)胞，接種于96孔板中，每孔中放置150 μL細(xì)胞液孵育24 h后轉(zhuǎn)染，分別于24、48、72、96、120 h向各孔內(nèi)加入20 μL的CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)6 h。在450 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的光密度(optical density, OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.8Transwell細(xì)胞侵襲和遷移實(shí)驗(yàn) 侵襲實(shí)驗(yàn)：將每孔50 μL結(jié)合基質(zhì)膠均勻地鋪在Transwell小室膜上，各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后將細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)整為每毫升4×105個(gè)細(xì)胞，將Transwell小室中200 μL細(xì)胞懸液置于24孔板培養(yǎng)基中，24 h后取出Transwell小室，用棉簽擦拭濾膜上層細(xì)胞經(jīng)甲醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，于顯微鏡下計(jì)數(shù)每膜15個(gè)隨機(jī)視野下透過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)平均值，每組設(shè)3個(gè)小室，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室膜上不鋪結(jié)合基質(zhì)膠，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜癌和正常子宮內(nèi)膜組織中LRP16蛋白的表達(dá)LRP16蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。免疫組化結(jié)果顯示，正常子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)陽(yáng)性減弱甚至陰性，子宮內(nèi)膜癌組織中細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈陽(yáng)性，正常子宮內(nèi)膜組織中LRP16蛋白陽(yáng)性率為13.33%(8/60)，子宮內(nèi)膜癌組織中LRP16蛋白的陽(yáng)性率為86.25%(138/160)，兩組相比差異有顯著性(P<0.01，圖1)。

圖1 A.LRP16在正常子宮內(nèi)膜組織中呈陰性，EliVision法；B.LRP16在子宮內(nèi)膜癌組織中呈陽(yáng)性，EliVision法

2.2 子宮內(nèi)膜癌中LRP16表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系本組結(jié)果顯示：子宮內(nèi)膜癌中LRP16表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)：FIGO分期越晚(Ⅰ+Ⅱ：79.45%、Ⅲ+Ⅳ：91.95%)、肌層浸潤(rùn)越深(≤1/2肌層：80.00%、>1/2肌層：91.11%)、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：76.00%、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：90.91%)的子宮內(nèi)膜癌中LRP16蛋白的陽(yáng)性率越高；LRP16表達(dá)與患者年齡無(wú)關(guān)(表1)。

2.3 Western blot法檢測(cè)LRP16蛋白表達(dá)與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌中LRP16蛋白表達(dá)明顯增高(圖2)，兩組相比差異有顯著性(P<0.01)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，LRP16蛋白表達(dá)明顯增加，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.38，P<0.01，圖3)。

2.4 RT-PCR檢測(cè)LRP16 mRNA表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，實(shí)驗(yàn)組LRP16 mRNA表達(dá)水平與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較均明顯降低，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=521.36，P<0.01，圖4)。

表1 子宮內(nèi)膜癌中LRP16表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 Western blot法檢測(cè)LRP16蛋白在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

圖3 Western blot法檢測(cè)ISK細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后LRP16蛋白的表達(dá)

圖4 RT-PCR檢測(cè)LRP16 mRNA的表達(dá)：與實(shí)驗(yàn)組比較，**P<0.01

2.5 轉(zhuǎn)染siLRP16對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，ISK細(xì)胞siLRP16轉(zhuǎn)染后24、48、72、96、120 h的抑制率分別為4.8%、16.4%、38.1%、44.5%和 52.6%，與陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

圖5 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染siLRP16對(duì)ISK細(xì)胞增殖的影響

2.6 轉(zhuǎn)染siLRP16對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)顯示，實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，細(xì)胞的侵襲和遷移能力均明顯降低。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基膜的細(xì)胞數(shù)量為41.0±6.5，與空白對(duì)照組(115.2±6.9)和陰性對(duì)照組(117.3±5.4)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)基膜的細(xì)胞數(shù)量為54.3±6.9，與空白對(duì)照組(176.2±5.6)和陰性對(duì)照組(125.8±2.6)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

3 討論

將子宮內(nèi)膜癌根據(jù)與雌激素受體的關(guān)系分為兩種類(lèi)型[7]：(1)非雌激素依賴(lài)性，常發(fā)生于萎縮的內(nèi)膜上，多見(jiàn)于老年絕經(jīng)后女性；(2)雌激素依賴(lài)性，常發(fā)生于年輕、圍絕經(jīng)期婦女，長(zhǎng)期無(wú)拮抗的雌激素刺激可能是其主要發(fā)病因素，常由不典型增生發(fā)展而來(lái)[8]。因此，尋找新的雌激素相關(guān)靶基因及其生物學(xué)功能的研究，在分子水平上對(duì)子宮內(nèi)膜癌的研究具有重要的診斷和治療價(jià)值。

LRP16基因是1999年解放軍總醫(yī)院采用限制性標(biāo)記基因組掃描及cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)發(fā)現(xiàn)的新的人類(lèi)基因[9-10]。該基因cDNA全長(zhǎng)980 bp。基因表達(dá)的高通量序列分析表明，該基因在人類(lèi)多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于其正常組織，尤其是雌激素依賴(lài)性腫瘤中高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)LRP16基因是雌激素信號(hào)通路上的核蛋白因子應(yīng)答基因，與雌激素依賴(lài)性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[11]。雖然LRP16的組成序列己經(jīng)明確，但在其功能調(diào)控以及在人體的作用研究尚少，本實(shí)驗(yàn)著重探討LRP16基因調(diào)控子宮內(nèi)膜癌增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移的規(guī)律，以促進(jìn)腫瘤病因?qū)W的發(fā)展。

為探討LRP16對(duì)子宮內(nèi)膜癌生物學(xué)功能是否具有調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LRP16在子宮內(nèi)膜癌及正常子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示：LRP16蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)(86.25%)明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織(13.33%)，兩者相比差異有顯著性(P<0.01)，提示LRP16蛋白的陽(yáng)性率隨著子宮內(nèi)膜組織向癌組織進(jìn)展明顯增加。本組還采用Western blot及RT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證了該結(jié)果；且LRP16表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)、FIGO分期、肌層浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，也提示LRP16 mRNA與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展明顯相關(guān)。CCK-8檢測(cè)LRP16 mRNA被干擾前、后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照組相比較，LRP16 mRNA被干擾后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞倍增時(shí)間明顯延長(zhǎng)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)?zāi)苣M腫瘤細(xì)胞消化基質(zhì)，并穿越屏障侵襲遷移的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LRP16 mRNA被干擾后，能夠穿越屏障的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比較明顯減少，這表明子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移能力受到抑制，說(shuō)明LRP16 mRNA與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

圖6 轉(zhuǎn)染siLRP16對(duì)ISK細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

本組發(fā)現(xiàn)LRP16基因表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，圍繞LRP16基因的各種基因檢測(cè)、干預(yù)方法將成為強(qiáng)有力的生物學(xué)檢測(cè)工具，對(duì)子宮內(nèi)膜癌高危人群的篩查、合理治療、預(yù)后評(píng)估及隨訪有指導(dǎo)意義。LRP16基因相關(guān)靶基因和信號(hào)通路影響子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的確切機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。