人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)及向心肌樣細(xì)胞分化

楊 曲，張衛(wèi)芳，陳 祺，胡 鋒，李 娟，羅 軍

目前，心肌疾病仍然是一類影響人們正常工作生活的難治性疾病，嚴(yán)重者甚至危及生命。雖然心臟康復(fù)治療在延緩其疾病進(jìn)程中取得了一定的進(jìn)展，但是對于受損心肌的再生修復(fù)仍是亟待解決的難題[1-2]。據(jù)報道干細(xì)胞可以通過在原位或體外分化為特定的細(xì)胞類型，從而替補或修復(fù)受損組織，為修復(fù)受損心肌患者帶來了新的希望[3-6]。人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amniotic mesenchymal stem cells， hAMSCs)來源于胚胎的纖維母細(xì)胞層，具有取材方便、無創(chuàng)、不受倫理限制、免疫排斥作用小且無成瘤性等眾多優(yōu)點[7-8]，且比其他來源的干細(xì)胞具有更好的增殖能力、分化潛能和組織修復(fù)能力，是用于再生修復(fù)的理想干細(xì)胞來源[9-11]。hAMSCs可被誘導(dǎo)向韌帶細(xì)胞[12]、肌腱細(xì)胞[13]、骨細(xì)胞[14]、肌細(xì)胞[15]和神經(jīng)元樣細(xì)胞[16]等定向分化，但關(guān)于其向心肌樣細(xì)胞分化的研究鮮有報道。因此，本文著重探討hAMSCs的原代培養(yǎng)及向心肌樣細(xì)胞分化的能力和機制，對hAMSCs治療心肌相關(guān)疾病具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2021年3 ～ 5月南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科10例健康、無傳染病的正常足月順產(chǎn)或剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤組織，血液樣本采自10名健康志愿者。人肝癌HepG2細(xì)胞，購自武漢普諾賽公司。免疫缺陷(NOD-SCID)小鼠，購自常州卡文斯公司。本實驗獲我院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 原代hAMSCs的分離培養(yǎng)與鑒定從胎盤上剝離羊膜，用D-Hank緩沖液充分沖洗。將羊膜濾除緩沖液后剪碎加入至0.05%胰酶中消化，37 ℃恒溫水浴1 h，每隔10 min使用振蕩器振蕩10 s。胰酶消化后收集羊膜，沖洗后轉(zhuǎn)移至1 g/L Ⅳ型膠原酶(Sigma公司)溶液中繼續(xù)消化，37 ℃恒溫水浴40 min，每隔10 min振蕩10 s，直至羊膜消化成膠狀物。消化完成后收集濾液至離心管，1 000 r/min離心5 min得到沉淀物；去上清液，沉淀物用含10% FBS和1%雙抗的DMEM/F12(Gibico公司)培養(yǎng)液重懸后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天換1次液，待細(xì)胞密度至80%～90%，用0.25%胰酶消化傳代。整個提取過程保持無菌，第3代生長狀態(tài)良好的hAMSCs用于后續(xù)實驗。用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面抗原CD44、CD90、CD45、HLA-DR的表達(dá)。

1.3 hAMSCs的多向分化潛能測定(1)成骨分化：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)50%～60%時，按間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)試劑盒對hAMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng)21天使用茜素紅染色評估成骨潛能。(2)成脂分化：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)100%或過度融合時，按間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)試劑盒進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，培養(yǎng)28天使用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴生成情況，以評估成脂潛能。

1.4 hAMSCs致瘤性檢測體內(nèi)實驗采用免疫缺陷小鼠體內(nèi)接種法：消化收集第3代的hAMSCs并進(jìn)行計數(shù)，PBS重懸備用，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×107個細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液與基質(zhì)膠按1 ∶1混勻，分別注入6周NOD-SCID小鼠的背部皮下及大腿內(nèi)側(cè)肌肉，記為hAMSCs組。相同方法植入人肝癌HepG2細(xì)胞，記為HepG2組。飼養(yǎng)1個月后，觀察兩組小鼠植入部位有無腫瘤形成。體外實驗采用軟瓊脂克隆法：取1×103個hAMSCs和HepG2細(xì)胞分別接種于6孔板軟瓊脂內(nèi)，培養(yǎng)10天后觀察細(xì)胞集落形成情況。

1.5 誘導(dǎo)hAMSCs向心肌樣細(xì)胞分化及形態(tài)學(xué)變化取第3代hAMSCs以每毫升2×104個細(xì)胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，分為對照組及實驗組。對照組用普通DMEM/F12完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，實驗組在接種24 h后更換為心肌誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含10 μmol/L 5-aza、5 μmol/L TGF-β1及5 μmol/L Ang-Ⅱ的DMEM/F12完全培養(yǎng)液)誘導(dǎo)24 h，再換液以普通DMEM/F12完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在不同時間點觀察實驗組和對照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化。

1.6 qRT-PCR檢測通過RNA提取試劑盒(Servicebio公司)提取實驗組和對照組細(xì)胞總RNA；取10 μL RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)完畢后取2.0 μL cDNA，采用Bio-rad熒光定量探測儀進(jìn)行基因表達(dá)定量分析，引物序列見表1，以GAPDH為內(nèi)參。進(jìn)行3次獨立實驗，結(jié)果數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT法分析。

表1 qRT-PCR實驗中各基因的引物序列

1.7 Western blot檢測收集實驗組和對照組培養(yǎng)4周后的細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，通過BCA法進(jìn)行蛋白定量，上樣，進(jìn)行SDS-PAGE法電泳，產(chǎn)物轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗抗人NKX2.5兔多克隆抗體(1 ∶1 000，Proteintech公司)在4 ℃孵育過夜，PBST沖洗。二抗山羊抗兔(1 ∶5 000，Proteintech公司)室溫孵育2 h，通過ECL法進(jìn)行曝光、顯影。條帶結(jié)果通過Image J軟件進(jìn)行半定量分析。

1.8 細(xì)胞免疫熒光檢測采用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測hAMSCs中cTnI和ACTN2的蛋白表達(dá)：取實驗組和對照組培養(yǎng)4周后的hAMSCs，PBS沖洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定15 min；0.5% Triton X-100室溫通透20 min；滴加10%山羊血清室溫封閉30 min；滴加兔單克隆cTnI抗體(1 ∶200，Abcam公司)或鼠單克隆ACTN2抗體(1 ∶200，Abcam公司)放入濕盒，4 ℃孵育過夜；TBST沖洗，分別滴加相應(yīng)的熒光二抗，在濕盒中室溫避光孵育1 h；滴加DAPI避光復(fù)染核5 min；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.9 CCK-8法檢測細(xì)胞活性將實驗組和對照組hAMSCs以5×103個細(xì)胞/孔接種于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24及48 h。加入CCK-8試劑(Solarbio公司)，孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450波長處檢測吸光度值(OD值)。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)置3個以上復(fù)孔。

1.10 淋巴細(xì)胞增殖實驗取健康人外周血，用Percoll淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞，用RPMI 1640培養(yǎng)基(Solarbio公司)重懸備用。取第3代實驗組和對照組hAMSCs，消化收集后用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，用絲裂霉素C(25 g/L)預(yù)處理3 h，加入外周血淋巴細(xì)胞懸液于96孔板中共培養(yǎng)，調(diào)整hAMSCs細(xì)胞終濃度為每毫升5×104個細(xì)胞，淋巴細(xì)胞終濃度為每毫升5×105個細(xì)胞，分別作為淋巴細(xì)胞+hAMSCs(對照組)共培養(yǎng)組和淋巴細(xì)胞+hAMSCs(實驗組)共培養(yǎng)組。將單獨淋巴細(xì)胞培養(yǎng)作為陰性對照組。用5 g/L植物血凝素(PHA)處理的淋巴細(xì)胞作為陽性對照。培養(yǎng)48 h后加入CCK-8試劑，孵育4 h用酶標(biāo)儀檢測吸光度值。實驗重復(fù)3次，每次設(shè)置3個以上復(fù)孔。

圖1 A.分離后的羊膜；B.第3代hAMSCs形態(tài)；C.茜素紅染色；D.油紅O染色

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測hAMSCs特異性表面抗原：A.CD44-APC；B.CD90-PE;C.CD45-APC;D.HLA-DR-FITC

2 結(jié)果

2.1 原代hAMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定用D-Hank液反復(fù)清洗去除人羊膜組織上的血液及絨毛膜后，可見羊膜呈透明狀薄膜(圖1A)。原代hAMSCs細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形、三角形、菱形及不規(guī)則形，可能是由于原代細(xì)胞中同時含有羊膜間充質(zhì)細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞。培養(yǎng)至第3代，細(xì)胞體積拉伸變大，形態(tài)趨于一致的長梭形，隨著細(xì)胞的增殖，呈現(xiàn)出干細(xì)胞典型的漩渦狀排列(圖1B)。經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，通過茜素紅染色可見大量鈣結(jié)節(jié)形成(圖1C)，油紅O染色可見大量脂滴形成(圖1D)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：hAMSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志基因CD44、CD90，低表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志基因CD45，不表達(dá)主要組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR(圖2)。

2.2 hAMSCs的致瘤性檢測為了檢測hAMSCs的植入安全性，體內(nèi)實驗用NOD-SCID小鼠細(xì)胞種植法，結(jié)果顯示：分別植入hAMSCs和HepG2細(xì)胞，飼養(yǎng)小鼠1個月，HepG2組小鼠在植入?yún)^(qū)可見明顯腫瘤形成，而hAMSCs組未見。體外實驗采用軟瓊脂克隆法，結(jié)果顯示：細(xì)胞培養(yǎng)10天后，HepG2組6孔板軟瓊脂內(nèi)可見明顯集落形成；而hAMSCs組內(nèi)未見細(xì)胞集落形成，與體內(nèi)實驗結(jié)果一致(圖3)。

圖3 hAMSCs體內(nèi)外致瘤性檢測：A.植入hAMSCs的NOD-SCID小鼠；B.種植hAMSCs的軟瓊脂；C.植入HepG2細(xì)胞的NOD-SCID小鼠；D.種植HepG2細(xì)胞的軟瓊脂

2.3 誘導(dǎo)hAMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的形態(tài)hAMSCs誘導(dǎo)前為短梭形，胞體較小，呈漩渦樣生長；誘導(dǎo)培養(yǎng)4周后細(xì)胞呈緊密平行排列生長，成纖維樣細(xì)胞比例下降，多數(shù)細(xì)胞增大，呈棒狀、長梭形，細(xì)胞間見細(xì)絲樣連接結(jié)構(gòu)。

2.4 hAMSCs誘導(dǎo)后心肌標(biāo)志基因和蛋白的表達(dá)本實驗進(jìn)一步檢測hAMSCs經(jīng)向心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化后心肌標(biāo)志基因(cTnI、ACTN2及NKX2.5)的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，實驗組cTnI、ACTN2及NKX2.5的mRNA表達(dá)水平均顯著上調(diào)，尤其NKX2.5表達(dá)上調(diào)達(dá)6倍以上(圖4A)。Western blot結(jié)果表明：與對照組相比，NKX2.5蛋白在實驗組的表達(dá)量明顯升高(圖4B、C)。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，實驗組在熒光顯微鏡下可見明顯的呈紅色熒光的cTnI及綠色熒光ACTN2蛋白表達(dá)，而對照組未見明顯表達(dá)(圖5、6)。

2.5 hAMSCs誘導(dǎo)后的細(xì)胞活性及免疫原性本組采用CCK-8實驗檢測對照組和實驗組中hAMSCs培養(yǎng)12、24及48 h的細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：實驗組和對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明誘導(dǎo)心肌分化后的hAMSCs仍保持良好的細(xì)胞活性(圖7A)。淋巴細(xì)胞增殖實驗顯示：與單純?nèi)送庵苎馨图?xì)胞組(陰性對照)相比，PHA可顯著刺激淋巴細(xì)胞增殖，未誘導(dǎo)(對照組)和誘導(dǎo)向心肌分化(實驗組)的hAMSCs分別與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，對淋巴細(xì)胞均無明顯促進(jìn)增殖作用，表明有、無誘導(dǎo)的hAMSCs均具有低免疫原性(圖7B)。

3 討論

間充質(zhì)干細(xì)胞又稱多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，是一種自我更新的細(xì)胞，廣泛存在于人體的器官和組織中，可以從脂肪組織、臍帶血、致密骨和其他組織中分離，被運用于各種實驗研究[17-18]。由于受多種原因的限制，間充質(zhì)干細(xì)胞的治療應(yīng)用一直受到阻礙。首先，成人來源的間充質(zhì)干細(xì)胞通常需要有創(chuàng)的侵入性操作來獲取，不僅導(dǎo)致患者痛苦，而且有可能使供體部位受到感染[19]；其次，間充質(zhì)干細(xì)胞的自我更新和分化潛能受到供體年齡、遺傳和微環(huán)境的嚴(yán)重影響[20-21]；再次，成體間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力和分化能力有限，在體外傳代培養(yǎng)后，其能力也進(jìn)一步降低[22]。因此，有必要尋找一種新的干細(xì)胞來源用于再生醫(yī)學(xué)的研究。有文獻(xiàn)報道，hAMSCs比其他來源的干細(xì)胞具有更活躍的增殖能力、細(xì)胞狀態(tài)更為原始、分化潛能更高[9]；具有令人滿意的低免疫原性、抗炎功能和組織修復(fù)能力[10]。其來源于廢棄胎盤上的羊膜，具有來源廣泛、對供者無不利影響、無倫理道德的限制等多種優(yōu)點[11]。所以，hAMSCs是更為理想的干細(xì)胞來源，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最有前途的干細(xì)胞[9]。

圖4 A.qRT-PCR檢測cTnI、ACTN2及NKX2.5的mRNA表達(dá)：*P<0.001、**P<0.000 1 ；B.Western blot檢測NKX2.5蛋白的表達(dá)；C.定量分析NKX2.5的表達(dá)：*P<0.001

圖5 實驗組與對照組hAMSCs免疫熒光染色，紅色為cTnI蛋白，藍(lán)色為DAPI核

圖6 實驗組與對照組hAMSCs免疫熒光染色，綠色為ACTN2蛋白，藍(lán)色為DAPI核

圖7 A.CCK-8實驗檢測對照組和實驗組hAMSCs的細(xì)胞活性；B.淋巴細(xì)胞增殖實驗檢測單純淋巴細(xì)胞組(陰性對照組)、淋巴細(xì)胞+PHA(陽性對照組)、淋巴細(xì)胞+hAMSCs(對照組)共培養(yǎng)組及淋巴細(xì)胞+hAMSCs(實驗組)共培養(yǎng)組的免疫原性：ns表示無相關(guān)性

心肌疾病是一類心肌器質(zhì)性疾病，包括缺血性心肌病、糖尿病心肌病或病毒性心肌炎等，均可導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，進(jìn)而損害正常的心肌功能，導(dǎo)致患者最終因心力衰竭而死亡[23-24]。盡管目前可以通過外源性的治療手段干預(yù)，但僅僅延緩了疾病進(jìn)展而無法修復(fù)和再生受損的心肌。利用干細(xì)胞的增殖、分化潛能，通過細(xì)胞移植手段再生和修復(fù)受損心肌組織、恢復(fù)心臟功能，是針對心肌病變本身治療心肌疾病最有希望的方法[25-26]。目前，由于各種技術(shù)手段及體內(nèi)復(fù)雜微環(huán)境的限制，干細(xì)胞移植治療并未達(dá)到預(yù)期的效果。其中主要的原因是移植入體內(nèi)的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的同時存在基因突變的可能，無法保證足夠的安全性和有效性。因此，通過在體外誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞定向分化，形成心肌樣前體細(xì)胞，再移植入體內(nèi)是更為安全有效的策略[27-29]。

本課題組通過機械-酶消化法成功提取了hAMSCs。由于原代hAMSCs中可能混有羊膜上皮細(xì)胞，細(xì)胞呈多形性，生長不一。經(jīng)過多次傳代純化后，第3代細(xì)胞形態(tài)均一，呈長梭形，漩渦式生長，增殖能力強。通過流式細(xì)胞術(shù)對第3代hAMSCs進(jìn)行干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記的鑒定，還進(jìn)一步通過體外成骨、成脂分化實驗證明提取的hAMSCs具有高度的多向分化潛能。此外，通過體內(nèi)外致瘤性檢測實驗及淋巴細(xì)胞增殖實驗表明hAMSCs兼具無致瘤性與低免疫原性的特點，可作為臨床應(yīng)用的細(xì)胞移植來源。

為了達(dá)到再生修復(fù)心肌組織的目的，本組進(jìn)一步研究了hAMSCs向心肌樣細(xì)胞分化的潛能。結(jié)果顯示，在體外通過心肌誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)hAMSCs，4周后可見細(xì)胞排列緊密有序，大多數(shù)細(xì)胞逐漸增大并形成棒狀，其胞間可見細(xì)絲樣的肌絲連接結(jié)構(gòu)。qRT-PCR結(jié)果顯示心肌特異性基因cTnI、ACTN2、NKX2.5的表達(dá)在誘導(dǎo)后明顯升高，細(xì)胞免疫熒光與Western blot實驗驗證了這些基因的轉(zhuǎn)錄后蛋白的表達(dá)水平也升高，表明誘導(dǎo)hAMSCs向心肌樣細(xì)胞分化成功，這為定向再生修復(fù)受損心肌提供了理論支持。其中，NKX2.5基因及其蛋白產(chǎn)物在對照組和實驗組中的表達(dá)差異更具有顯著性，與其他干細(xì)胞誘導(dǎo)向心肌分化的報道相似[30-31]，提示hAMSCs通過高表達(dá)NKX2.5基因是其向心肌樣細(xì)胞分化的可能機制，但需進(jìn)一步驗證。此外，通過CCK-8實驗和淋巴細(xì)胞增殖實驗表明誘導(dǎo)向心肌分化的hAMSCs具有良好的細(xì)胞活性及低免疫原性，這為hAMSCs應(yīng)用于臨床提供了安全性和有效性的保障。

本組成功從人羊膜中提取出hAMSCs，并創(chuàng)新性的誘導(dǎo)其向心肌樣細(xì)胞定向分化，提高細(xì)胞移植治療心肌損傷的安全性和有效性，為臨床治療心肌疾病提供了新的再生修復(fù)策略。