廣西香花油茶炭疽病病原菌鑒定及生物學(xué)特性

廖旺姣，韋 維，鄒東霞，鐘雅婷，羅 輯，葉 航

(廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院/廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西林業(yè)有害生物天敵繁育工程技術(shù)研究中心，南寧 530002)

【研究意義】香花油茶(CamelliaosmanthaYe CX，Ma JL et Ye H)是2012 年在廣西南寧市發(fā)現(xiàn)的山茶屬短柱茶組新物種，其獨(dú)特的表型性狀有別于其他山茶屬油茶(C.oleiferaAbel.)，表現(xiàn)早熟、果量多、出籽率高、抗逆性強(qiáng)，而且樹(shù)型美觀、花帶香氣，是有望在廣西大力推廣種植的油茶物種和觀賞樹(shù)種[1]。自2015年以來(lái)，本課題組在調(diào)查普通油茶及香花油茶病蟲(chóng)害時(shí)，發(fā)現(xiàn)香花油茶試驗(yàn)林常有炭疽病發(fā)生，其中疏于管理、生長(zhǎng)較差的植株發(fā)生較嚴(yán)重。目前，鮮見(jiàn)因炭疽病導(dǎo)致油茶嚴(yán)重?fù)p失的報(bào)道，對(duì)成林香花油茶炭疽病病原菌的了解甚少。因此，密切關(guān)注香花油茶炭疽病的發(fā)生為害動(dòng)態(tài)，準(zhǔn)確鑒定其病原菌和掌握其生物學(xué)特性，對(duì)香花油茶的抗病育種及其炭疽病防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】香花油茶的研究主要集中在苗木快速繁育[2]、栽培[3]、生理[4-5]、茶油[6-7]、葉片和果殼的綜合利用[8-10]、園林應(yīng)用[11]等方面，針對(duì)其病蟲(chóng)害的研究報(bào)道較少。已有研究將香花油茶苗期炭疽病病原菌報(bào)道為Colletotrichumfructicola[12]。常明山等[13]研究表明，香花油茶對(duì)普通油茶炭疽病菌膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的抗性表現(xiàn)為中抗，感病油茶的酶活性與感病指數(shù)存在明顯相關(guān)。韋維等[14]研究報(bào)道，香花油茶對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)的抗性表現(xiàn)為中抗。李德偉等[15]研究發(fā)現(xiàn)，香花油茶對(duì)茶黃硬薊馬(Scirtothripsdorsalis)具有較強(qiáng)抗性。李河等[16-17]研究指出，C.fructicola是湖南油茶炭疽病的優(yōu)勢(shì)病原菌，也是江西、福建和湖北等省油茶的炭疽病病原菌。李楊等[18]研究認(rèn)為，C.fructicola是海南油茶炭疽病病原菌之一，該菌在10～35 ℃均能生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃；菌絲在pH 4～11 范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，在pH為6時(shí)生長(zhǎng)最快，12 h光暗交替有利于其菌絲生長(zhǎng)；可利用多種碳源，其中對(duì)葡萄糖和麥芽糖的利用效果較好；對(duì)牛肉膏和酵母浸粉2種氮源的利用效果較好，對(duì)氯化銨和硫酸銨的利用效果最差。劉倩麗等[19]研究表明，C.fructicola是海南檀香炭疽病病原菌，其菌絲及分生孢子均能在 10～35 ℃條件下生長(zhǎng)，最適菌絲生長(zhǎng)溫度及最適分生孢子萌發(fā)溫度均為 30 ℃；菌絲及分生孢子萌發(fā)的 pH為 4～11，最適菌絲生長(zhǎng)及分生孢子萌發(fā)的pH 分別為 6和 5，光照最有利于菌絲生長(zhǎng)，而黑暗條件有利于分生孢子萌發(fā)；該菌對(duì)蔗糖和可溶性淀粉等碳源利用效果較好，對(duì)蛋白胨、 尿素、 酵母膏浸粉和硫酸銨等氮源利用效果較佳；該菌菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍、pH范圍及最適pH與海南油茶炭疽病菌相同，對(duì)酵母浸粉的利用效果也與海南油茶炭疽病菌一致。宋麗麗等[20]研究結(jié)果顯示，C.fructicola是上海和安徽草莓(Fragariaananassa)炭疽病的病原菌，其最適生長(zhǎng)溫度為 25～30 ℃，最佳 pH 為 6～7，可利用葡萄糖等多種碳源和銨鹽等多種氮源。上述來(lái)源于不同地域油茶、檀香和草莓3種寄主的同一病原菌均為C.fructicola，其生物學(xué)特性有相同之處也存在一定差異，說(shuō)明不同寄主和不同地域?qū).fructicola的生物學(xué)特性具有明顯影響?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，廣西香花油茶栽培面積日益擴(kuò)大，但對(duì)成林香花油茶炭疽病病原菌的分類地位尚不清楚，對(duì)其病原菌的生物學(xué)特性尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以隨機(jī)采樣法采集廣西區(qū)內(nèi)香花油茶試驗(yàn)林典型炭疽病樣品，采用傳統(tǒng)形態(tài)特征觀察與現(xiàn)代分子生物學(xué)即病原菌多基因系統(tǒng)分析相結(jié)合的方法，明確香花油茶炭疽菌的分類地位，采用平板法測(cè)定溫度、酸堿度和光照等因子對(duì)病原菌的影響，為香花油茶品種的抗病選育及病害防治技術(shù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試香花油茶炭疽病樣品采集于廣西南寧市、來(lái)賓市和崇左市香花油茶林；健康香花油茶葉片采自廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院油茶苗圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離及致病性測(cè)定 參考朱英芝等[21]的組織分離法獲得疑似病原菌株，分離菌株產(chǎn)孢后，挑取單孢，獲得純培養(yǎng)，保存至PDA斜面試管培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)6 d后，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用傷口接種法進(jìn)行離體葉片和活體葉片接種試驗(yàn)，選取香花油茶炭疽病病原菌的代表菌株CXNN02、CXLB08和CXCZ09為測(cè)試菌株。離體葉片接種法：采集健康香花油茶葉片，自來(lái)水清洗干凈，75%酒精表面消毒，再用蘸有無(wú)菌水的棉球擦拭葉片3次，置于底部鋪有濾紙的白色透明塑料盒中，葉片基部用蘸有無(wú)菌水的棉球保濕。用滅菌接種針在近葉尖處創(chuàng)造1個(gè)2 mm的微傷口，移液器接種20 μL分生孢子液(6.00×106個(gè)孢子/mL)至傷口上，以接種無(wú)菌水為對(duì)照，接種測(cè)試菌株和對(duì)照各20張葉片，置于室溫中培養(yǎng)。活體葉片接種法：在苗圃中選擇健康香花油茶植株，選定從頂葉向下數(shù)的第3～6張成熟葉片，接種前葉片處理與離體葉片接種法相同。用手持小型噴霧器將分生孢子液噴灑至葉片滴水，以噴灑無(wú)菌水為對(duì)照，然后用密封袋將植株密封，48 h后解開(kāi)密封袋。接種測(cè)試菌株和對(duì)照各20張。10 d后觀察發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和測(cè)量病斑大小。將發(fā)病葉片與對(duì)照葉片分離，比較接種發(fā)病葉片獲得分離菌株的形態(tài)與接種菌株是否一致，依據(jù)柯赫氏法確定致病菌。

1.2.2 病原菌鑒定 病原菌形態(tài)鑒定：選擇菌株CXNN02為測(cè)試菌株，接種到PDA培養(yǎng)基上，黑暗條件、25 ℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察。培養(yǎng)7 d后，記錄菌株培養(yǎng)性狀和菌落直徑，鏡檢、拍攝和測(cè)量100個(gè)病原分生孢子和20個(gè)分生孢子附著胞大小[22]。

病原菌基因序列測(cè)定及多基因系統(tǒng)分析：參考植物基因組試劑盒說(shuō)明提取病原菌基因組DNA，參考朱英芝等[21]的油茶炭疽病菌多基因系統(tǒng)分析法，對(duì)核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、肌動(dòng)蛋白(ACT)、幾丁質(zhì)合成酶(CHS1)和3-磷酸甘油醛脫氫酶(GPDH)進(jìn)行擴(kuò)增、序列測(cè)定和多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建分析。

1.2.3 生物學(xué)特性測(cè)定分析 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響：將菌株CXNN02在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，以內(nèi)徑為6 mm的滅菌打孔器在菌落邊緣打取菌餅，供生物學(xué)特性測(cè)定用。溫度試驗(yàn)設(shè)10、15、20、25、28、30、35和40 ℃共8個(gè)溫度，將打取的菌餅接種至PDA平板培養(yǎng)基后，放置在上述溫度及黑暗條件下培養(yǎng)，每個(gè)溫度處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，7 d后用“十”字交叉法測(cè)定不同溫度培養(yǎng)基中的炭疽病病原菌菌落直徑，10 d后用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定產(chǎn)孢量[23]，以確定菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適溫度。

pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響：用1.0 mol/L的HCl和NaOH調(diào)制pH 4～12(間隔為1)的 PDA培養(yǎng)基，將測(cè)試菌株的菌餅接種至上述平板培養(yǎng)基上，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后用“十”字交叉法測(cè)定不同pH培養(yǎng)基中的炭疽病病原菌菌落直徑，以確定菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適pH。

碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響：供試D-麥芽糖、D-葡萄糖和馬鈴薯淀粉等10種碳源，分別以等質(zhì)量碳含量加入不含蔗糖的查彼培養(yǎng)基中配置成培養(yǎng)基，將測(cè)試菌株的菌餅接種至上述含不同碳源培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后用“十”字交叉法測(cè)定不同碳源培養(yǎng)基中的炭疽病病原菌菌落直徑，以確定菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適碳源。

氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響：供試硫酸銨、L-谷氨酸和牛肉膏等10種氮源，分別以等質(zhì)量氮含量加入不含硝酸鈉的查彼培養(yǎng)基中配置成培養(yǎng)基，供試菌株菌餅接種至上述含不同氮源培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后用“十”字交叉法測(cè)定不同氮源培養(yǎng)基中的炭疽病病原菌菌落直徑，以確定菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適氮源。

光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響：將供試菌株的菌餅接種至PDA平板培養(yǎng)基上，分別置于完全黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照(8W，燈皿距離20 cm，下同)條件下25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后用“十”字交叉法測(cè)定不同光照條件培養(yǎng)基中的炭疽病病原菌菌落直徑，以確定菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適光照條件。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理，以DPS 13.01的Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 香花油茶炭疽病的發(fā)病癥狀

香花油茶炭疽病可危害葉片、嫩葉和嫩梢，其發(fā)病癥狀與普通油茶炭疽病相似。其中，葉片感病多從葉緣開(kāi)始，病斑呈半圓形或不規(guī)則形擴(kuò)展，后期病斑中央呈灰白色 (圖1-A)；嫩葉感病多從葉尖開(kāi)始，病斑呈V字形擴(kuò)展，隨著葉片枯死面積的增大，感病部位向葉背卷曲，嚴(yán)重時(shí)整張嫩葉枯死；嫩梢感病呈褐色或黑色，由上至下逐漸枯死。

A：炭疽病癥狀；B：接種發(fā)病狀；C：菌落正面；D：菌落背面；E：分生孢子；F：分生孢子附著孢A：Symptoms of leaf anthracnose；B：Symptom of inoculation；C：Colony on PDA；D：Reverse of colony；E：Conidia；F：Conidial appressoria圖1 香花油茶炭疽病的發(fā)病癥狀及病原菌Fig.1 Symptoms and pathogens of C. osmantha anthracnose

2.2 香花油茶炭疽病病原菌的分離及致病性測(cè)定

從廣西南寧市、來(lái)賓市和崇左市香花油茶林分別采集到30、20和26株菌株，共計(jì)76株，其菌落形態(tài)基本一致，為同一類型的炭疽菌。代表菌株 CXNN02、CXLB08和CXCZ09均可致病，接種3 d后，接種點(diǎn)開(kāi)始變褐色，病斑隨后逐漸擴(kuò)展，10 d 后2種接種方法接種的葉片均發(fā)病，病斑大小各異，其中，離體接種法接種的病斑平均直徑分別為6.48、6.39和5.20 mm(圖1-B)，活體葉片接種法接種的病斑比離體接種法略小，病斑平均直徑分別為5.53、5.33和 4.97 mm，對(duì)照的接種點(diǎn)變褐色，但未擴(kuò)展。從發(fā)病葉片中再次分離獲得的菌株形態(tài)與接種菌株一致，而從對(duì)照葉片中未分離到任何菌株。因此，確定接種菌株為香花油茶炭疽病的致病菌株。

2.3 香花油茶炭疽病病原菌的鑒定

2.3.1 病原菌的形態(tài)特征 菌株CXNN02在PDA培養(yǎng)基上菌落呈圓形，邊緣整齊，菌絲灰色至深灰色，氣生菌絲茂盛，絨毛狀，菌落中心產(chǎn)生孢子堆(橘紅色)，背面產(chǎn)生黑色色素(圖1-C和圖1-D)。菌絲生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落平均直徑為82.25 mm，平均生長(zhǎng)速率為11.75 mm/d。分生孢子光滑，無(wú)色，單胞，圓柱狀，基部平截，頂端鈍圓或略尖，具有1～2個(gè)油球，大小為(13.30～20.67)μm×(3.39～7.48)μm，平均為(15.89±1.29)μm×(5.66±0.72)μm(圖1-E)。分生孢子附著胞淺褐色至褐色，單個(gè)或多個(gè)，圓形或近圓形，邊緣完整，少數(shù)呈不規(guī)則形，大小為(6.50～10.69)μm×(5.17～9.50)μm，平均為(8.17±0.75)μm×(7.16±5.66)μm(圖1-F)，形態(tài)特征與核果炭疽菌(C.fructicola)一致[22]。

2.3.2 病原菌分子生物學(xué)分析 經(jīng)病原菌基因序列測(cè)定，獲得代表菌株CXNN02、CXLB08和CXCZ09的ITS、ACT、CHS1和GPDH基因序列，其在 GenBank 的登錄號(hào)分別為OM212453-OM212455、OM304374-OM304376、OM273502-OM273504和OM250039-OM250041，經(jīng)BLAST比對(duì)，其同源性均為100.0%。下載相關(guān)參考序列，用MEGA 5.0的鄰接法構(gòu)建上述4個(gè)多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果(圖2)發(fā)現(xiàn)，CXNN02、CXLB08和CXCZ09菌株與核果炭疽菌菌株聚集在一起形成一個(gè)進(jìn)化分支，與除C.siamense外的其他7個(gè)進(jìn)化分支距離較遠(yuǎn)，各分支支持率均較高，達(dá)99.0%或100.0%。結(jié)合傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征分析，確定CXNN02、CXLB08和CXCZ09菌株所在的進(jìn)化分支代表一個(gè)獨(dú)立的種，均屬于核果炭疽菌，說(shuō)明香花油茶炭疽病病原菌為核果炭疽菌。

圖2 基于ITS、ACT、CHS1和GPDH基因序列構(gòu)建的炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree inferred from combined partial ITS，ACT，CHS1 and GPDH sequences data of Colletotrichum

2.4 香花油茶炭疽病病原菌(核果炭疽菌)的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由表1可知，香花油茶炭疽病病原菌生長(zhǎng)的溫度范圍較廣，在10～35 ℃均能生長(zhǎng)，其中，在28和30 ℃下培養(yǎng)生長(zhǎng)較好，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑分別為83.19 和81.86 mm，二者差異不顯著(P>0.05，下同)，但均極顯著高于其他溫度培養(yǎng)的病原菌菌落直徑(P<0.01，下同)；在25 ℃下培養(yǎng)的病原菌菌落直徑也較大，為75.09 mm，極顯著高于除28和30 ℃下培養(yǎng)外的其他溫度培養(yǎng)的病原菌菌落直徑；在10～28 ℃溫度范圍，隨著溫度的升高，菌絲生長(zhǎng)逐漸加速，在28 ℃時(shí)菌落直徑達(dá)最大，超過(guò)28 ℃后，菌絲生長(zhǎng)速度逐漸下降，在30～35 ℃生長(zhǎng)速度急劇下降，菌落直徑從81.86 mm下降至14.22 mm，降幅達(dá)82.63%。說(shuō)明高溫不利于香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)，而香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的最佳溫度為28～30 ℃。

表1 溫度對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Table 1 Effects of temperature on mycelium growth and sporulation of C.fructicola

適宜香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢的溫度范圍較菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍略窄。其中，在15～28 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，產(chǎn)孢量大幅度增加，尤其在15～20 ℃下產(chǎn)孢量增幅最大，從2.33×106個(gè)/mL增加至24.83×106個(gè)/mL，增加9.67倍；在28 ℃下產(chǎn)孢量最大，為53.33×106個(gè)/mL，而后開(kāi)始下降，在30～35 ℃下產(chǎn)孢量下降尤其明顯，從35.83×106個(gè)/mL下降至6.67×106個(gè)/mL，下降81.38%。差異顯著性分析結(jié)果顯示，28 ℃下培養(yǎng)的病原菌產(chǎn)孢量極顯著高于其他溫度培養(yǎng)的產(chǎn)孢量，25和30 ℃下培養(yǎng)的病原菌產(chǎn)孢量差異不顯著，但二者均顯著大于除28 ℃下培養(yǎng)外的其他溫度培養(yǎng)的病原菌產(chǎn)孢量(P<0.05，下同)。說(shuō)明20～30 ℃適合香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢，尤以28 ℃為最佳。

2.4.2 pH對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 由表2可知，香花油茶炭疽病病原菌在pH為 4～11的培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)，隨著pH的升高，菌絲生長(zhǎng)速度逐漸降低。其中，pH為4～5時(shí)，菌絲生長(zhǎng)最好，菌落直徑分別為76.95和79.09 mm，二者間差異不顯著，但均極顯著大于在其他pH條件下培養(yǎng)病原菌的菌落直徑；在pH為12時(shí)，菌絲停止生長(zhǎng)。說(shuō)明香花油茶炭疽病病原菌適合在弱酸性條件下生長(zhǎng)，強(qiáng)堿性不利于該菌生長(zhǎng)。

表2 pH對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Table 2 Effects of pH on mycelium growth and sporulation of C. fructicola

適宜香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的pH為4～10，較適宜菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基pH范圍略小。

其中，pH為6時(shí)產(chǎn)孢量最大，為35.00×106個(gè)/mL，其次分別是pH 5和pH 4，產(chǎn)孢量分別為31.67×106和10.67×106個(gè)/mL；在pH為 6～8范圍內(nèi)，隨著pH的升高產(chǎn)孢量下降，尤以pH為6～7時(shí)下降更明顯，從pH為6時(shí)的35.00×106個(gè)/mL下降至pH為7時(shí)的10.50×106個(gè)/mL，產(chǎn)孢量下降70.00%。差異顯著性分析結(jié)果顯示，pH 為6時(shí)的病原菌產(chǎn)孢量顯著大于pH為5時(shí)的病原菌產(chǎn)孢量，極顯著大于其他pH時(shí)的病原菌產(chǎn)孢量。說(shuō)明弱酸性條件有利于香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢。

2.4.3 不同碳源對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 由表3可知，供試10種碳源均可促進(jìn)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，其中，香花油茶炭疽病病原菌對(duì)D-麥芽糖、D-葡萄糖、D-果糖和D-木糖4種碳源的利用效果較好，培養(yǎng)7 d時(shí)菌落直徑分別為85.18、83.43、83.05和82.35 mm，四者間差異不顯著，但均極顯著大于其他碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑；香花油茶炭疽病病原菌對(duì)半乳糖利用效果最差，其菌絲生長(zhǎng)的菌落直徑僅29.51 mm。說(shuō)明半乳糖可抑制香花油茶炭疽病病原菌生長(zhǎng)。

表3 碳源對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響Table 3 Effects of carbon sources on mycelium growth and sporulation of C. fructicola

香花油茶炭疽病病原菌在10種碳源培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量存在差異。其中，在乳糖培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最大，為36.50×106個(gè)/mL，其次是在D-果糖培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢量為15.00×106個(gè)/mL，產(chǎn)孢量最小的是D-山梨醇培養(yǎng)基，為6.17×106個(gè)/mL。說(shuō)明D-山梨醇可抑制該菌生長(zhǎng)。

2.4.4 不同氮源對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 由表4可知,香花油茶炭疽病病原菌在供試的10種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢。其中，菌絲在牛肉膏、蛋白胨和酵母粉3種有機(jī)氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，菌落直徑分別為86.98、86.97和84.53 mm，三者間差異不顯著，但除在酵母粉氮源培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落直徑與在L-谷氨酸培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌落直徑差異不顯著外，三者均極顯著大于其他氮源培養(yǎng)的菌落直徑；香花油茶炭疽病病原菌在硫酸銨培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最差，菌落直徑僅37.38 mm。說(shuō)明硫酸銨可抑制香花油茶炭疽病病原菌生長(zhǎng)。

表4 氮源對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響Table 4 Effects of nitrogen sources on mycelium growth and sporulation of C. fructicola

香花油茶炭疽病病原菌在10種氮源培養(yǎng)基中的產(chǎn)孢量存在差異，以在酵母粉培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量最大，達(dá)105.33×106個(gè)/mL，其次是在蛋白胨和牛肉膏培養(yǎng)基中，產(chǎn)孢量分別為63.50×106和35.33×106個(gè)/mL，三者間差異極顯著，且三者均極顯著大于其余7種氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的產(chǎn)孢量。說(shuō)明酵母粉、蛋白胨和牛肉膏3種有機(jī)氮源可促進(jìn)香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢。

2.4.5 不同光照對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響 表5顯示，香花油茶炭疽病病原菌在完全黑暗、12 h光暗交替和連續(xù)光照條件下生長(zhǎng)，其菌落直徑分別為84.56、84.46和81.99 mm，以完全黑暗和12 h光暗交替條件下生長(zhǎng)較佳，二者間的菌落直徑差異不顯著，但均極顯著大于連續(xù)光照條件下培養(yǎng)的菌落直徑。說(shuō)明黑暗條件有利于香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)。

表5 光照對(duì)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的影響Table 5 Effects of light on mycelium growth and sporulation of C. fructicola

3種光照條件對(duì)香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢量影響顯著，其中以完全黑暗條件下產(chǎn)孢量最大，為24.00×106個(gè)/mL，其次是12 h光暗交替，產(chǎn)孢量為12.50×106個(gè)/mL，產(chǎn)孢量最小的是連續(xù)光照，為7.33×106個(gè)/mL。說(shuō)明黑暗條件最有利于香花油茶炭疽病病原菌產(chǎn)孢。

3 討 論

本研究通過(guò)病原菌形態(tài)特征觀察和病原菌核糖體ITS、ACT、CHS1和GPDH多基因分子系統(tǒng)學(xué)分析，將從廣西南寧市、來(lái)賓市和崇左市香花油茶林地采集分離的炭疽病病原菌確定為核果炭疽菌，該菌與廣西普通油茶炭疽病病原菌膠孢炭疽菌[21]、山茶炭疽菌(C.camelliae)不同[24]，但與曾報(bào)道的香花油茶苗期炭疽病菌相同[12]。核果炭疽菌在江西、湖南和海南等地的油茶上已有報(bào)道[16-18]，其寄主范圍較廣，除油茶外，國(guó)外在小?？Х?Coffeaarabica)、草莓、深波葉補(bǔ)血草(Limoniumsinense)、葡萄(Vitisvinifera) 和沙梨(Pyruspyrifolia)等作物上也發(fā)現(xiàn)由該菌引起的炭疽病[25]，國(guó)內(nèi)在檀香[19]、草莓[20]、棉花(Gossypiumhirsutum)[22]、茶樹(shù)(C.sinensis)[26]、蘋果(Maluspumila)[27]、蓮霧(Syzygiumsamarangense)[28]、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)[29]、桑樹(shù)(Morusalba)[30]、芒果(Mangiferaindica)[31]和玉米(Zeamays)[32]等作物上均有該菌引起炭疽病發(fā)生的報(bào)道。本研究分離、鑒定獲得的香花油茶炭疽病菌株，經(jīng)培養(yǎng)其菌落性狀(呈圓形，邊緣整齊，菌絲灰色至深灰色，氣生菌絲茂盛，絨毛狀，菌落中心產(chǎn)生橘紅色孢子堆，背面產(chǎn)生黑色色素)與彭友良和王源超[12]報(bào)道的香花油茶苗期炭疽病病原菌的培養(yǎng)性狀一致，但菌落顏色較后者略淺；與李河等[16]報(bào)道的湖南油茶炭疽病病原菌菌落性狀相似，但分生孢子堆顏色(淺黃色)存在差異，可能與菌株來(lái)源不同有關(guān)。

生物學(xué)特性測(cè)定分析結(jié)果顯示，適宜香花油茶炭疽病病原菌生長(zhǎng)的溫度為10～35 ℃、最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，與李楊等[18]報(bào)道的海南油茶炭疽病病原菌適宜生長(zhǎng)溫度和最適生長(zhǎng)溫度一致，但最適生長(zhǎng)溫度與劉倩麗等[19]、宋麗麗等[20]報(bào)道的炭疽病病原菌最佳生長(zhǎng)溫度為30 ℃相比偏低；香花油茶炭疽病病原菌在pH為4～11范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，與李楊等[18]、劉倩麗等[19]的研究結(jié)果一致，而最適菌絲生長(zhǎng)的pH為4～5，比海南油茶炭疽病病原菌[18]、檀香炭疽病病原菌[19]菌絲最適生長(zhǎng)pH為6和草莓炭疽病病原菌[20]菌絲最佳生長(zhǎng)pH為6～7偏低，說(shuō)明香花油茶炭疽病病原菌適合在弱酸性條件下生長(zhǎng)；完全黑暗有利于香花油茶炭疽病病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，與劉倩麗等[19]報(bào)道光照有利于檀香炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)的結(jié)果不一致，而黑暗有利于產(chǎn)孢，二者的研究結(jié)果一致；香花油茶炭疽病病原菌在D-麥芽糖、D-葡萄糖、D-果糖和D-木糖等碳源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較好，與劉倩麗等[19]的研究結(jié)果相似；香花油茶炭疽病病原菌在蛋白胨氮源培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最好、尿素能較好地促進(jìn)香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)，與劉倩麗等[19]的研究結(jié)果一致；香花油茶炭疽病菌對(duì)硫酸銨的利用效果最差，而劉倩麗等[19]報(bào)道的硫酸銨能較好地促進(jìn)檀香炭疽病病原菌生長(zhǎng)，二者的研究結(jié)果存在差異，可能與菌株的寄主不同及地域來(lái)源不同有關(guān)。本研究觀察測(cè)定的香花油茶炭疽病病原菌生物學(xué)特性與其他寄主植物上的炭疽病病原菌存在一定差異，與劉文魁[33]報(bào)道不同寄主上的C.fructicola在生物學(xué)特性方面存在較大差異的研究結(jié)果相符。

4 結(jié) 論

采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合方法，確定廣西香花油茶炭疽病病原菌為核果炭疽菌，香花油茶是核果炭疽菌的新寄主。 香花油茶炭疽病病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢受溫度、pH、碳氮源和光照條件影響明顯，進(jìn)行香花油茶抗病品種選育、制定炭疽病防治措施時(shí)需充分了解該菌的生物學(xué)特性。