冠突曲霉Ac-nsdD基因鑒定分析及抗鹽脅迫功能分析

余春芳, 曹廣鑫,張亭笛,吳炅臻,楊 靖,譚玉梅,劉永翔,劉作易,位秀麗

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室, 湖北 十堰 442000; 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院, 湖北 十堰 442000; 3.湖北醫(yī)藥學(xué)院第一臨床學(xué)院, 湖北 十堰 442000; 4.湖北醫(yī)藥學(xué)院第三臨床學(xué)院, 湖北 十堰 442000; 5.貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550006; 6.貴州省生物技術(shù)研究所, 貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】茯磚茶是一種已有400多年歷史的黑茶[1]。茯磚茶產(chǎn)量曾突破100億元，在中國(guó)和東北亞地區(qū)非常受歡迎[2]。從茯磚茶中分離到的優(yōu)勢(shì)真菌是冠突曲霉(Aspergilluscristatus)，從茯磚茶生產(chǎn)至茯磚茶成品一直出現(xiàn)[[3-4]。冠突曲霉的菌絲體富含人體各種必需氨基酸[4]。冠突曲霉通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群對(duì)小鼠肥胖有功效[5], 粗胞外多糖EPSs-2具有調(diào)節(jié)腸道微生物群的免疫調(diào)節(jié)活性[6]。冠突曲霉有效利用化癥回生口服液的殘留物來(lái)生產(chǎn)9種藥用有價(jià)值的蒽醌類(lèi)化合物[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】茯磚茶表面生長(zhǎng)“金花菌”,實(shí)際是冠突曲霉的閉囊殼，其質(zhì)量和數(shù)量多少?zèng)Q定茯磚茶的品質(zhì)[8]。閉囊殼的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程受到許多來(lái)自外源環(huán)境如：光照、溫度、滲透壓和營(yíng)養(yǎng)成分等的調(diào)控，同時(shí)也受到來(lái)自?xún)?nèi)源性遺傳因子的調(diào)控[9]。絲狀真菌的GATA 轉(zhuǎn)錄因子的C末端存在一段IV 型鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域：C-X2-C-X(17-20)-C-X2-C，迄今為止，在文獻(xiàn)報(bào)道中，真核生物中GATA轉(zhuǎn)錄因子主要發(fā)揮6個(gè)方面的作用：①對(duì)氮代謝的調(diào)控作用；如在輪狀鐮刀霉菌中[10]；②與毒力作用相關(guān)，如在白假絲酵母中[11]；③調(diào)控響應(yīng)鐵離子信號(hào)刺激而生物合成鐵素，如在莢膜組織胞漿菌中[12]；④調(diào)控交配型，如在新型隱球菌中[13]；⑤調(diào)控有性發(fā)育、分生孢子產(chǎn)生、有性及無(wú)性發(fā)育平衡，如在構(gòu)巢曲霉中[14-16]；⑥響應(yīng)光和細(xì)胞分裂素的調(diào)節(jié)，如在擬南芥中[17]。目前研究主要在其復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在粗糙脈孢中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)與WCC和SUB-1的GATA轉(zhuǎn)錄因子相偶聯(lián)的一個(gè)光調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控子囊殼發(fā)育和幾乎所有的后期光反應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組分析在冠突曲霉E4中鑒定了一個(gè)關(guān)鍵的具有保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ZnF GATA轉(zhuǎn)錄因子nsdD[2]。筆者分析冠突曲霉轉(zhuǎn)錄因子Ac-nsdD也應(yīng)該具有絲狀真菌的GATA轉(zhuǎn)錄因子類(lèi)似的功能，在調(diào)控冠突曲霉生長(zhǎng)發(fā)育中應(yīng)該也起到調(diào)控作用，特別是在真菌生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系方面值得開(kāi)展深入的研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】冠突曲霉是一種同宗配合的絲狀真菌，具有不同的有性和無(wú)性繁殖模式。但冠突曲霉的細(xì)胞過(guò)程高度依賴(lài)于環(huán)境脅迫下的調(diào)控，在低滲透壓條件下，該真菌有性發(fā)育產(chǎn)生閉囊殼；在高滲透壓條件下，無(wú)性發(fā)育產(chǎn)生灰綠色孢子[2,19]，潛在的分子機(jī)制仍不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究進(jìn)一步探討了GATA轉(zhuǎn)錄因子Ac-nsdD在茯磚茶的冠突曲霉中的調(diào)控作用，有助于研究與Ac-nsdD基因相偶聯(lián)的一些信號(hào)通路及其下游基因，最終為研究絲狀真菌的有性及無(wú)性發(fā)育的一些共有的和獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

冠突曲霉E4(GZAAS20.1004)由貴州省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，pdht/sk-hyg質(zhì)粒來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所植物生理生態(tài)研究所，突變體菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室。M3Y培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM按照文獻(xiàn)[20]配方配置。

1.2 蛋白序列的獲得與分析

以冠突曲霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的Ac-NsdD蛋白序列為靶蛋白，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行blastp搜索，獲得同源蛋白序列，分別使用BioEdit 7.0.5.3和MEGA 7.0軟件最大似然法(maximum likelihood)進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析。

1.3 基因敲除載體的構(gòu)建和突變體的獲得

以冠突曲霉E4的基因組DNA為模板，用引物NsdD-Lf和NsdD-Lr擴(kuò)增冠突曲霉Ac-nsdD開(kāi)放閱讀框(ORF)上游757 bp的片段，克隆到載體pdht/sk-hyg的XhoI和BamH I酶切位點(diǎn)之間，即為pdht/sk-hyg-NsdDL；同理，擴(kuò)增冠突曲霉Ac-nsdD開(kāi)放閱讀框(ORF)下游880 bp的片段克隆到中間載體pdht/sk-hyg-NsdDL的SpeI和XbaI酶切位點(diǎn)之間，即為基因敲除載體pdht/sk-hyg-NsdDL-NsdDR(此研究命名為PDK30)。采用CaCl2凍融法將敲除載體質(zhì)?；蚯贸d體PDK30轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌LBA4404。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將含敲除載體質(zhì)粒基因敲除載體PDK30的根癌農(nóng)桿菌LBA4404實(shí)現(xiàn)絲狀真菌冠突曲霉E4的遺傳轉(zhuǎn)化，詳細(xì)步驟按照文獻(xiàn)[21]。PCR方法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，引物詳見(jiàn)表1。突變體參照地高辛雜交檢測(cè)試劑盒Ⅰ說(shuō)明書(shū)進(jìn)行Southern blot雜交驗(yàn)證，以質(zhì)粒pDHt-sk-hyg為模板擴(kuò)增hyg部分片段，利用隨機(jī)引物法和地高辛標(biāo)記的核苷酸DIG-1dUTP對(duì)hpy部分片段DNA進(jìn)行標(biāo)記獲得探針，探針引物信息參考文獻(xiàn)[22]，使用BamH I的酶對(duì)突變體基因組DNA進(jìn)行酶切。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物Table 1 Primers needed for the experiment

1.4 突變體表型分析

1.4.1 生長(zhǎng)速度測(cè)定 用半徑0.5 cm的打孔器取菌絲塊接種至M3Y、含5%和17% NaCl M3Y培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)；分別在第3、5、7、14天測(cè)量菌落直徑，每天進(jìn)行拍照。

1.4.2 產(chǎn)孢量分析 用半徑0.5 cm的打孔器取菌絲塊接種至M3Y、含5%和17% NaCl M3Y培養(yǎng)基, 28 ℃倒置培養(yǎng)，分別在第3和7天后用5 mL無(wú)菌水洗并收集孢子，2層擦鏡紙過(guò)濾孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)孢子的數(shù)量。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件中t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ac-NsdD的生物信息學(xué)分析

根據(jù)冠突曲霉基因組數(shù)據(jù)庫(kù)注釋[2]，Ac-nsdD基因編碼一個(gè)假定的具有保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ZnF GATA的轉(zhuǎn)錄因子，共430個(gè)氨基酸。在C端含有1個(gè)GATA型鋅指保守結(jié)構(gòu)域(SMART accession number：smart00401),將其命名為Ac-NsdD。

從圖1-A可以看出，Ac-NsdD蛋白與謝瓦曲霉(Aspergilluscristatus)、灰綠曲霉(Aspergillusglaucus)、赤曲霉(Aspergillusruber)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)等多種曲霉菌親緣關(guān)系非常接近，而與芒果畸形病病原菌(Fusariummangiferae)等親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。此外，多序列比對(duì)顯示，在不同曲霉物種間，NsdD蛋白的C端具有較高序列保守性。一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ZnF-GATA在冠突曲霉的370～411 aa的位置被發(fā)現(xiàn)，并與構(gòu)巢曲霉及其他曲霉種同源(圖1-B)。

A:不同真菌Ac-NsdD蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用MEGA 7.0軟件最大似然法(maximum likelihood)，自舉數(shù)據(jù)集為1000次。B:不同曲霉種Ac-NsdD 蛋白的C端保守區(qū)域的氨基酸序列比對(duì)。在構(gòu)巢曲霉假定的ZnF-GATA鋅指結(jié)構(gòu)域，在冠突曲霉、謝瓦曲霉、赤曲霉、灰綠曲霉、黑曲霉、米曲霉、黃曲霉也被觀察到A:Phylogenetic tree of Ac-NsdD proteins in different fungi. Phylogenetic trees were generated using MEGA 7.0 with the maximum-likelihood model with a bootstrap value of 1000. B: Amino acid sequence alignment of VeA C-terminal conserved regions from different Aspergillus species. The putative ZnF-GATA in A. nidulans is also observed in A. cristatus, A. chevalieri, A. ruber, A. glaucus, A. niger, A. oryzae, A. flavus圖1 Ac-NsdD蛋白同源性分析Fig.1 Homology analysis of Ac-NsdD proteins

2.2 Ac-NsdD基因敲除突變體的獲得

如圖2所示，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別擴(kuò)增同源重組目的基因的上下游片段，將目的片段先后酶切連接到質(zhì)粒pDK30。經(jīng)酶切驗(yàn)證無(wú)誤后，引物NsdD-f1和引物NsdD-r1用于根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法長(zhǎng)片段驗(yàn)證。經(jīng)PCR驗(yàn)證，得到了基因功能缺失轉(zhuǎn)化子ΔAc-nsdDY12(圖3-A)。經(jīng)Southern blot驗(yàn)證，hyg基因以單拷貝方式成功整合到轉(zhuǎn)化子ΔAc-nsdDY12的基因組(圖3-B)。

圖2 敲除質(zhì)粒構(gòu)建原理Fig.2 Principle of construction kocking out vector

A: 2：突變體菌株Y12, 目標(biāo)片段是3035 bp；1, 3, 6, 7：野生型菌株, 目標(biāo)片段是1092 bp；4，5：假陽(yáng)性菌株，目標(biāo)片段：大片段是3035 bp，小片段是1092 bp；M：DNA marker。B: WT：野生型菌株；Y12：突變體菌株，目標(biāo)片段是約600 bpA: 2: Mutant strain Y12, the target product size fragment was 3035 bp; 1, 3, 6, 7: Wild-type strains, the target product size fragment was 1092 bp; 4, 5: False positive strains, the target product of big size fragment was 3035 bp, the target product of small size fragment was 1092 bp; M：DNA marker. B: WT: DNA marker; Y12: Mutant strain, the target product size fragment was 600 bp圖3 突變體PCR檢測(cè)和Southern blot驗(yàn)證Fig.3 PCR detection and Southern blot validation results of mutant strains

2.3 Ac-NsdD基因敲除突變體產(chǎn)閉囊殼量顯著減少

突變株在M3Y培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d后，如圖4所示，與野生型菌株相比，閉囊殼數(shù)目顯著減少，這結(jié)果表明Ac-nsdD基因在無(wú)鹽環(huán)境下可能激活有性發(fā)育。

圖4 野生型菌株(WT)和突變菌株Y12在M3Y培養(yǎng)基3 d的菌落表型Fig.4 Colony phenotype of wild type (WT) and mutant strain Y12 cultures on M3Y for 3 days

2.4 Ac-NsdD基因參與冠突曲霉對(duì)NaCl鹽脅迫的應(yīng)答

突變株在含5% NaCl M3Y培養(yǎng)基培養(yǎng)至3 d，與野生型菌株相比，閉囊殼數(shù)目顯著減少(圖7)，然而分生孢子顯著變多(圖5-B和圖7)。培養(yǎng)至7 d，突變株中間培養(yǎng)物黑色色素形成顯著增加(圖5-B)。這些結(jié)果表明，Ac-nsdD基因在應(yīng)答低滲透壓鹽脅迫條件下，可能激活有性發(fā)育和抑制無(wú)性發(fā)育，平衡有性和無(wú)性發(fā)育，且影響色素的生物合成。

圖5 野生型菌株(WT)和突變菌株Y12在含5% NaCl的M3Y培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d(A和B)和7 d(C和D)的菌落表型Fig.5 Colony phenotype of wild type(WT) and mutant strain Y12 cultured on M3Y containing 5% NaCl for 3 days(A and B) and 7 days (C and D)

突變株在含17% NaCl M3Y 培養(yǎng)基培養(yǎng)至7 d，與野生型菌株相比，閉囊殼數(shù)目幾乎為零，分生孢子數(shù)目減少，生長(zhǎng)速度變小(圖6-B和圖7)；然而當(dāng)其培養(yǎng)從7～14 d，突變株幾乎不生長(zhǎng)(圖6-B，圖6-D和圖7)。這些結(jié)果表明Ac-nsdD基因在應(yīng)答高滲透壓鹽脅迫條件下，可能激活有性發(fā)育、無(wú)性發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。

圖6 野生型菌株(WT)和突變菌株Y12在含17% NaCl的M3Y培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d (A和B)和14 d (C和D)的菌落表型Fig.6 Colony phenotype of wild type strain(WT) and mutant strain Y12 cultured on M3Y containing 17% NaCl for 7 days ( A and B ) and 14 days ( C and D )

顯示的值是5次重復(fù)的平均值，誤差條表示標(biāo)準(zhǔn)差，“*”表示P<0.05即實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)意義Values shown are means for five replicates, error bars indicate standard deviations,‘*’ P<0.05 is statistically significant圖7 野生型菌株(WT)和突變菌株Y12在不同滲透壓下閉囊殼或分生孢子的數(shù)目、菌落的直徑和生長(zhǎng)速度Fig.7 Wild-type strain (WT) and mutant strain Y12 cultures the numbers of cleistothecia or conidia, the colony diameters, growth rates under different osmotic pressures

3 討 論

NsdD及其同源物在許多絲狀真菌中被鑒定為具有保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ZnF GATA的轉(zhuǎn)錄因子[14-15, 18, 23-27]。迄今為止，在文獻(xiàn)報(bào)道和本工作中，nsdD及其同系物主要發(fā)揮6個(gè)方面的作用，包括①抑制無(wú)性發(fā)育，如在曲霉(Aspergillusspp.)[15,27]、水稻惡苗病菌(Fusariumfujikuroi)[25]、核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)[26]和草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)中；②激活有性發(fā)育，在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)[14]、核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)[26]、大孢糞殼霉菌(Sordariamacrospora)[23]和本研究中確認(rèn)；③在特定條件下影響次級(jí)代謝物的產(chǎn)生，如曲霉中的黑色色素和膠霉毒素[15,27]和本研究中確認(rèn)；聚酮合酶來(lái)源的色素，如在水稻惡苗病菌(F.fujikuroi)[25]和草酸青霉菌(P.oxalicum)；④調(diào)節(jié)光反應(yīng)，在粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)[18]和灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)[24]；⑤調(diào)控真菌的毒力，在壞死營(yíng)養(yǎng)型植物病原體灰葡萄孢菌(B.cinereal)[24]；⑥調(diào)節(jié)植物的生產(chǎn)生物質(zhì)降解酶,這些酶基因的表達(dá)在草酸青霉菌(P.oxalicum)確認(rèn)[28]。

在本研究中當(dāng)ΔAc-nsdD菌株在含有5% NaCl無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)物中間變黑，表明Ac-nsdD基因抑制色素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)，這可能與水稻惡苗病菌(F.fujikuroi)的Csm1類(lèi)似[25]。值得注意的是，聚酮合成酶(PKSs)有助于絲狀真菌的黑色素的生物合成，以及馬爾尼菲青霉菌(Penicilliummarneffei)中的紅曲紅素、桔青霉素和紅曲黃素[29]。一般來(lái)說(shuō)，真菌分泌的天然色素是復(fù)雜的混合物。例如，馬爾尼菲紅色素含有超過(guò)16種化合物，包括單紅紅蛋白和紅點(diǎn)蛋白的氨基酸結(jié)合物[30]。因此，Ac-nsdD基因?qū)ι厣锖铣上嚓P(guān)基因的調(diào)控值得進(jìn)一步研究。

滲透壓在絲狀真菌的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要的作用[31-32]。冠突曲霉的細(xì)胞過(guò)程高度依賴(lài)于環(huán)境脅迫下的調(diào)控，在低滲透壓條件下，該真菌有性發(fā)育產(chǎn)生有性孢子；在高滲透壓條件下，無(wú)性發(fā)育產(chǎn)生無(wú)性孢子。在這項(xiàng)研究中，證明Ac-nsdD基因在滲透應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用。在應(yīng)答5% NaCl鹽環(huán)境脅迫條件下，Ac-nsdD缺失突變體與WT相比，分生孢子數(shù)目顯著增加，閉囊殼數(shù)目顯著減少。因此,我們推測(cè)Ac-nsdD基因參與對(duì)外界刺激低滲透壓鹽脅迫的應(yīng)答，激活有性發(fā)育和抑制無(wú)性發(fā)育，平衡有性和無(wú)性發(fā)育。該轉(zhuǎn)錄因子在冠突曲霉中的作用與其他子囊菌有性發(fā)育必需因子nsdD在維持有性及無(wú)性發(fā)育平衡中起的作用一致[14-15]。

ΔAc-nsdD突變菌株在17% NaCl介導(dǎo)的滲透脅迫下培養(yǎng)7 d，與野生型菌株相比，分生孢子數(shù)目減少，生長(zhǎng)速度變小。眾所周知，分生孢子產(chǎn)生是由3種轉(zhuǎn)錄因子brlA、abaA和wetA組成的中心調(diào)控途徑嚴(yán)格控制的，這3種轉(zhuǎn)錄因子與FLBs等其他基因協(xié)同調(diào)控作用，這些作為真菌生命周期的一個(gè)整合部分[33]。在曲霉的分生孢子和生長(zhǎng)中菌絲中，nsdD通過(guò)抑制brlA的表達(dá)在產(chǎn)分生孢子中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。相比之下，在發(fā)育中的細(xì)胞，在vosA基因作用下，nsdD敲除激活了brlA的表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)分生孢子進(jìn)一步激活[15,27]。細(xì)胞內(nèi)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)綜合性的網(wǎng)絡(luò)，但由于其特有的生態(tài)位，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜的、多層次的，其中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的信號(hào)、胞外酶的分泌和分生孢子產(chǎn)生的通路調(diào)控是重要的部分。它們是由不同的調(diào)控因子共同調(diào)控的，如Velvet家族蛋白蛋白，G蛋白和RAS蛋白，這些蛋白具有全面調(diào)控作用[33]。

4 結(jié) 論

冠突曲霉Ac-nsdD基因與編碼GATA型鋅指轉(zhuǎn)錄因子的nsdD基因同源。本研究不僅提供了與nsdD同源基因激活有性發(fā)育和在特定條件下影響次級(jí)代謝物的產(chǎn)生的一般作用一致的證據(jù)，但也證實(shí)了Ac-nsdD基因參與應(yīng)答低滲透壓鹽脅迫條件下，共同調(diào)節(jié)冠突曲霉的色素的生物合成、分生孢子產(chǎn)生和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這為深入理解GATA型鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制，及絲狀真菌的滲透壓應(yīng)答、色素的生物合成、有性和無(wú)性孢子通路和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)信號(hào)通路的精細(xì)交叉調(diào)控提供了新的思路。