菲律賓蛤仔糖胺聚糖的分離純化及結構表征

詹雯琦，劉淑集，李水根，蔡水淋，路海霞，王茵，劉智禹*

（1.福建師范大學，福建 福州 350007；2.福建省水產研究所國家海水魚類加工技術研發(fā)分中心（廈門），福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 廈門 361013；3.福建省海洋職業(yè)技術學校，福建 福州 350000）

菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）又稱花蛤、雜色蛤等，北方俗稱蛤蜊，隸屬于雙殼綱、蛤蜊科，廣泛分布于遼寧、山東、福建等南北海區(qū)，是我國近海四大養(yǎng)殖貝類之一[1]，其產量大、價格不高，且肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，已成沿海地區(qū)百姓餐桌常見的一種水產品。目前，菲律賓蛤仔主要以生鮮形式銷售，少部分加工成罐頭等形式，產品附加值低。傳統(tǒng)中醫(yī)認為菲律賓蛤仔可入藥，《中華本草》中也記載其藥效?，F(xiàn)今已有大量研究報道，菲律賓蛤仔富含多肽、多糖、糖胺聚糖、糖蛋白等生物活性物質[2-4]，具有抗氧化[5-6]、降血糖[7]、降血脂[8]、抗腫瘤[9-10]、抑菌[11]、抗凝血[12]、促進鐵吸收[13]等活性。

糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs），屬于一種雜多糖，是一類由重復的二糖結構單一組成的帶有負電荷的長鏈大分子，具有羧基和硫酸基團[14]。學者認為，多糖的生物活性與它的分支度、溶解性、空間結構、取代基種類等因素密切相關[15-16]。GAGs結構特殊，其二糖單位為己糖醛酸和己糖胺，具有較強的生物活性[17]，成為生物高分子中的研究熱點。近年來，國內外已從海參[18]、牡蠣[19]、扇貝[20]、合浦珠母貝[21]等海洋生物中分離到了GAGs。因此，本文以養(yǎng)殖菲律賓蛤仔為原料，采用水酶法提取GAGs，并通過離子色譜、紫外光譜、傅里葉紅外光譜及核磁共振技術對提取到的GAGs進行分離純化與結構表征，為該GAGs的結構研究奠定基礎，也為菲律賓蛤仔等海洋貝類的高值化應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設備

旋渦混合儀（XW-80A）：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；臺式高速冷凍離心機（5810R）：德國Eppendorf公司；紫外-可見分光光度計（UV-3200）：上海美譜達儀器公司；程控全自動部分收集器（CBS-B）：上海滬西分析儀器廠有限公司；電子分析天平（BSA8201）：賽多利斯科學儀器有限公司；蠕動泵驅動器（BT100J-1A）：慧宇偉業(yè)流體設備有限公司；旋轉蒸發(fā)器（R系列）：上海申生科技有限公司；冷凍干燥機（SCIENTZ-10N）：寧波新芝生物科技公司；傅里葉紅外光譜儀（380FT-IR）：美國 Nicolet公司；核磁共振儀（Bruker-AVANCE600）：德國 Bruker公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菲律賓蛤仔GAGs的制備

稱取50 g菲律賓蛤仔勻漿后，添加9 800 U/g中性蛋白酶，按料液比1∶1（g/mL）加入去離子水，50℃下酶解5 h，所得酶解液煮沸10 min滅酶。冷卻至室溫（24℃～26℃）后，10 000 r/min離心 10 min，收集上清液。調節(jié)上清液的pH值為7.0，加入95%乙醇（3倍體積），混勻，置于4℃下24h。后 4000r/min，離心15min，取沉淀。冷凍干燥得到菲律賓蛤仔GAGs粗品，得率為1.04%。用阿利新藍法[22]測定糖胺聚糖含量為7.13%（以干基計）。

1.3.2 DEAE-650M離子交換色譜分離純化菲律賓蛤仔GAGs

用去離子水清洗去除DEAE-650M中的細小顆粒，配制成凝膠，脫氣，裝柱，以去離子水為溶劑，以流速1 mL/min平衡24 h。

將GAGs粗品用去離子水配制濃度為90 mg/mL的溶液，過0.45 μm濾膜除雜、上柱。依次用去離子水和 0.25、0.50、0.75、1.00 mol/L NaCl溶液進行洗脫，以1 mL/min的流速收集，每管收集5 mL，用阿利新藍比色法[22]檢測各管GAGs含量，每一濃度梯度洗脫至無洗脫峰出現(xiàn)。合并相同組分的洗脫峰、透析、濃縮、真空冷凍干燥得GAGs純化品。

1.3.3 紫外光譜分析

超高速動能武器對地打擊毀傷效應主要包括直接侵徹、撞擊成坑以及地沖擊毀傷[1,13-14] 3種。根據固體侵徹、半流體侵徹和流體動力學侵徹，分別計算侵徹深度、成坑范圍和地沖擊效應。

將所得的GAGs純化品用蒸餾水配制成1 mg/mL溶液，在波長190 nm～600 nm進行紫外光譜掃描，以蒸餾水作空白對照。

1.3.4 傅里葉紅外光譜分析

稱取GAGs純化品2 mg，加入干燥的KBr晶體200 mg，于瑪瑙研缽中研磨均勻，取適量壓片成透明狀，在4 000 cm-1～400 cm-1進行傅里葉紅外光譜儀掃描分析。

1.3.5 核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析

稱取100 mg的菲律賓蛤仔GAGs純化品，溶解于600 μL的重水（D2O），在試驗溫度為 25℃條件下，應用Bruker-AVANCE 600核磁共振儀進行13C-NMR和1H-NMR圖譜分析。

2 結果與分析

2.1 菲律賓蛤仔GAGs的分離純化結果

菲律賓蛤仔GAGs粗品洗脫曲線見圖1。

圖1 菲律賓蛤仔GAGs粗品洗脫曲線Fig.1 The elution curve of crude GAGs from Ruditapes philippinarum

如圖1所示，菲律賓蛤仔GAGs粗品經DEAE-650M離子交換柱層析分離得到2個峰，GAG-1和GAG-2，分別為 0.50、0.75 mol/L NaCl溶液洗脫部分。經檢測，GAG-1的糖胺聚糖含量較高，為89.56%，是粗品的1.82倍，而GAG-2含量很低。收集峰GAG-1，經透析、凍干后得淺黃色的菲律賓蛤仔GAGs純化品，顏色較粗品的淺褐色淡，說明DEAE-650M離子交換柱層析可以起到脫除色素的作用。

2.2 菲律賓蛤仔GAGs紫外光譜分析

利用紫外光譜對菲律賓蛤仔GAGs粗品、GAG-1和GAG-2分別進行全波長掃描，結果如圖2所示。

圖2 菲律賓蛤仔GAGs粗品、純化品紫外光譜分析Fig.2 The UV spectrum of crude GAGs，GAG-1 and GAG-2 from Ruditapes philippinarum

由圖2可知，菲律賓蛤仔GAGs粗品、GAG-1和GAG-2 3個樣品的紫外光譜曲線基本重疊，在200 nm左右波長處有強吸收峰出現(xiàn)，說明其含有羧基；在250 nm～280 nm波長處有小吸收峰，說明可能含有少量的核酸或蛋白質雜質[23]。而GAG-1和GAG-2在260 nm和280 nm處的吸收與GAGs粗品相比有所降低，說明經過DEAE-650M柱層析后除去了少量的雜質，起到了純化的效果。

2.3 菲律賓蛤仔GAG-1紅外光譜分析

紅外光譜圖上的每個特征吸收峰，都是由相對應的分子或原子或官能團振動引起的。對菲律賓蛤仔GAG-1在4 000 cm-1～400 cm-1進行紅外光譜掃描，其結構分析結果如圖3所示。

圖3 GAG-1的紅外光譜圖Fig.3 The infrared spectrum of GAG-1

由圖3可知，GAG-1在3426.62cm-1和1071.27cm-1處有強吸收，是因為糖分子內或分子間氫鍵的O-H伸縮振動和O-H變角振動（一級），說明有糖環(huán)醇羥基的存在[23]；在波數(shù)2 922.15 cm-1附近的吸收，說明是糖類的特征峰，存在糖環(huán)上亞甲基C-H伸縮振動[23]；在波數(shù)1 645.99 cm-1附近有C=O鍵伸縮振動的特征吸收峰，說明結構中存在乙酰氨基[24]；而在波數(shù)1 549.49、1 383.17、1 233.75 cm-1處均為羧基的吸收峰，分別是由C=O非對稱伸縮振動、C=O對稱伸縮振動以及OH變角振動引起；在波數(shù)927.03 cm-1處有吡喃環(huán)吸收峰，說明存在非對稱環(huán)伸縮振動；在波數(shù)848.32 cm-1附近的吸收峰，說明結構中存在硫酸基[25]。以上現(xiàn)象均說明GAG-1具備糖胺聚糖的基本特征[26]。由圖3分析可知，菲律賓蛤仔GAG-1含有羧基、乙酰氨基、硫酸基等。

2.4 菲律賓蛤仔GAG-1核磁共振分析

一維核磁共振氫譜（1H-NMR）一般可用于分析糖苷鍵構型，大多數(shù)質子共振峰集中在化學位移δ 3.0～4.5，圖譜峰重疊較嚴重[27]。一維核磁共振碳譜（13C-NMR）可用于測定糖殘基數(shù)目、異頭碳構型、糖鏈的連接位置等，但因其測定的化學位移值范圍較大，致使其具有信號重疊少、分辨率高等特點，廣泛應用于多糖結構的測定[28]。對菲律賓蛤仔GAG-1分別進行1H-NMR和13C-NMR圖譜掃描檢測，結果如圖4和圖5所示。

圖4 菲律賓蛤仔GAG-1的1H-NMR圖譜Fig.4 The1H-NMR spectrum of GAG-1 from Ruditapes philippinarum

圖5 菲律賓蛤仔GAG-1的13C-NMR圖譜Fig.5 The13C-NMR spectrum of GAG-1 from Ruditapes philippinarum

在1H-NMR譜（圖4）中，化學位移1.99處的峰為GlcNAc的甲基信號[15]?；瘜W位移3.5～4.5之間是糖環(huán)上各氫信號；化學位移3.93和3.73處分別為GlcNAc和Gal的H2吸收峰；化學位移4.27和4.14處分別為Gal的H3和GlcNAc的H4吸收峰；化學位移4.50處為Gal H1吸收峰。由于化學位移4.95是α吡喃糖H1質子和β構型吡喃糖H1質子化學位移的分界點[29]，圖4中沒有大于4.95的峰，說明菲律賓蛤仔GAG-1的糖環(huán)構型為β-構型[30]。

在13C-NMR譜圖（圖5）中，化學位移22.50處為GlcNAc-C2位上的乙酰基中甲基吸收峰?；瘜W位移61.02和68.66處分別是6-硫酸化-GlcNAc-C6和6-硫酸化-Gal-C6的吸收峰。而非端基碳（C2、C3、C4和 C5）未發(fā)生取代的信號在化學位移70.92～74.58，且共振峰重疊嚴重；化學位移77.34處的峰取代質子信號，表示樣品為1，4-糖苷鍵連接；化學位移104.30、103.71和103.56這3處峰比較強，分別是異頭碳的化學位移，且均大于103，表明這可能存在3個單糖[31]，且都是β構型，這與1H-NMR分析結果一致。化學位移177.37、174.99、174.05處為己糖醛酸羧基或乙酰氨基的信號[32]。

因此，綜合1H-NMR和13C-NMR圖譜分析結果，說明菲律賓蛤仔GAG-1是以β-D-Glc（1→4）-為主要的連接方式。但是由于GAG-1的糖胺聚糖含量只有89.56%，純度不高，1H-NMR和13C-NMR兩種圖譜雜峰較多，無法精確判斷糖殘基的類型和相對含量。

3 討論與結論

本文采用水酶法從菲律賓蛤仔中提取了GAGs粗品，經DEAE-650M柱層析純化后得到GAG-1和GAG-2等2個組分，其中GAG-1的糖胺聚糖含量為89.56%，比粗品提高了82.43%，而GAG-2含量很低。通過光譜檢測可以判斷分離純化后的菲律賓蛤仔GAG-1的分子結構中存在羧基、乙酰氨基、硫酸基等基團，與王瑞芳等[33]的研究結果類似，她們分離的菲律賓蛤仔糖胺聚糖F-1-1主要含有氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖等。同時，通過NMR檢測分析結果顯示菲律賓蛤仔GAG-1的單體為吡喃型，并以β-D-Glc（1→4）-為主要連接方式，與范秀萍等[34]等分離出的菲律賓蛤仔糖胺聚糖RG-1相吻合，RG-1主要由葡萄糖、氨基半乳糖和半乳糖通過1→6、1→4或1→4、6鍵連接構成主鏈，在主鏈中還含有大量半乳糖醛酸。但是，本研究對于菲律賓蛤仔GAG-1的分離純化及結構分析還不夠，紫外光譜顯示還存在著微量的核酸或蛋白質雜質，有待于今后結合凝膠色譜等其他手段進一步純化，再采用二維核磁共振、高碘酸氧化、質譜、Smith降解等方法對其結構進行表征，以便為糖胺聚糖構效關系的研究提供參考依據。