不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草有效成分的影響

錢朋智，張梅娟，王韜，郭宏文，王艷菊，甄珍

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省哈爾濱市海關(guān)技術(shù)中心齊齊哈爾綜合實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.ex Fr.）Link.]，又名北蟲草、北冬蟲夏草，為子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌目（Clavicipitales）麥角菌科（Clavicipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）真菌，是重要的食藥兩用真菌，可與冬蟲夏草相媲美。在我國，蛹蟲草目前已大規(guī)模種植，廣泛分布于廣東、山東、遼寧、吉林等地[1]。2009年我國衛(wèi)生部正式將蛹蟲草批準(zhǔn)為新資源食品，2014年更名為“新食品原料”[2]。

蛹蟲草含有蟲草素、蟲草多糖、麥角甾醇和纖溶酶等多種天然生物活性物質(zhì)[3-4]。蟲草素是核苷類物質(zhì)，其含量是衡量蛹蟲草質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)之一[5-7]；此外，蟲草素具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用[8]；有研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草中含有蟲草素和噴司他丁兩種獨特的有效成分，是冬蟲夏草的良好替代品[3，9]。蟲草多糖是主要由甘露糖、半乳糖和葡萄糖等組成的多聚糖，是蛹蟲草活性物質(zhì)中重要的物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等作用[1，10]。麥角甾醇是微生物細(xì)胞膜的重要組成部分，是具有生物活性的化合物；蛹蟲草麥角甾醇在抑菌、降脂、防腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面具有顯著功效[11-12]。纖溶酶是能專一降解纖維蛋白凝膠的蛋白水解酶，蛹蟲草纖溶酶具有溶栓抗脂等生物活性功能[2，13]。

作為一種“新食品原料”，蛹蟲草的營養(yǎng)和保健功能越來越受到人們的認(rèn)可[14]，而對其活性成分進(jìn)行評價能更好地反映其內(nèi)在品質(zhì)。谷物是培養(yǎng)蛹蟲草的原料之一，具有來源廣泛、價格低廉、質(zhì)量可靠等優(yōu)點。不同谷物的營養(yǎng)成分和理化性質(zhì)有一定差異，培養(yǎng)所得的蛹蟲草菌絲共生體或子實體中功能成分含量不同。目前，人工栽培的蛹蟲草子實體大多選用大米、小麥等培養(yǎng)基質(zhì)，固體基質(zhì)較單一，且目標(biāo)多為提高子實體中的蟲草素含量，對其他活性物質(zhì)如粗多糖、麥角甾醇和纖溶酶的研究相對較少；而且市場上蛹蟲草的活性成分差異較大，對蛹蟲草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成了一定的影響[1]。培育蛹蟲草菌絲共生體或子實體的目的：一是直接用于產(chǎn)品的開發(fā)制備，二是對蛹蟲草培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取和利用。培養(yǎng)含有特定活性物質(zhì)和功能的蛹蟲草產(chǎn)品，是蛹蟲草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必然趨勢。而合適的培養(yǎng)基對蛹蟲草菌絲共生體或子實體的生長及活性物質(zhì)的合成具有促進(jìn)作用。因此，本研究以高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]、糜子（Panicum miliaceum L.）和油莎豆（Cyperus esculentus L.）3 種谷物為培養(yǎng)基質(zhì)，接種蛹蟲草液體菌種，檢測不同培養(yǎng)基質(zhì)中蛹蟲草菌絲共生體和子實體的主要有效活性成分含量，以期為蛹蟲草優(yōu)良品質(zhì)以及產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱、糜子、油莎豆（均為食品級）：產(chǎn)于齊齊哈爾市泰來縣；蛹蟲草斜面菌種（母種）：齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物研究室。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）、麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；苯酚、高錳酸鉀、葡萄糖、濃硫酸（均為分析純）：北京索萊寶生物科技有限公司；草酸、甲醇、乙醇（均為色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血纖維蛋白原、牛凝血酶（500 U/mL）：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院天津血液研究所。

谷物培養(yǎng)基質(zhì)的配制：分別向耐高溫（140℃）高壓玻璃罩栽培器中添加高粱、糜子和油莎豆各100 g，并添加適量水，121℃高壓0.1 MPa滅菌1 h，冷卻至25℃?zhèn)溆谩?/p>

液體菌種培養(yǎng)基的配制：稱取馬鈴薯20 g，加水100 mL，在加熱器上加熱至沸騰，用紗布進(jìn)行過濾。向濾液中加入葡萄糖2 g，定容至100 mL，121℃高壓0.1 MPa滅菌15 min，冷卻至25℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX）：上海申安醫(yī)療器械有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9243BS-Ⅲ）：上海新苗儀器有限公司；多功能小型粉碎機（J-02）：上海淀久中藥機械制造有限公司；超聲波清洗器（Q-600B）：昆山市超聲儀器有限公司；臺式離心機（TDL-80-2B）：上海安亭科學(xué)儀器廠；超純水制備儀（Millipore）：密理博有限公司；紫外可見分光光度計（TU-1901）：北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜儀（Agilent 1290）：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 液體菌種的制備

無菌條件下，用無菌接種鏟在斜面母種處取0.5cm×0.5 cm菌種10塊，放至250 mL液體菌種培養(yǎng)基中，在溫度23℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)3 d～4 d，待培養(yǎng)基中出現(xiàn)顆粒均勻的球狀菌絲且菌液澄清透明、無分層后停止培養(yǎng)，得到的菌液即為蛹蟲草液體菌種。

1.3.2 高粱、糜子和油莎豆培育蛹蟲草試驗

1.3.2.1 菌絲共生體培養(yǎng)

無菌條件下，將液體菌種接種于3種谷物培養(yǎng)基質(zhì)上，接種量為2.5%（即液體種子的體積占培養(yǎng)料濕料質(zhì)量的百分比）。接種后放入無菌栽培室中，避光培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度18℃、濕度60%。菌絲萌發(fā)后定期觀察并記錄菌絲生長情況，直至菌絲布滿整個培養(yǎng)基質(zhì)時停止培養(yǎng)，此時得到的谷物培養(yǎng)基質(zhì)和菌絲體共存的整體即為谷物蛹蟲草菌絲共生體，簡稱菌絲共生體。檢測菌絲共生體中的蟲草素含量、粗多糖含量、麥角甾醇含量和纖溶酶酶活。

1.3.2.2 子實體培養(yǎng)

將布滿菌絲體的培養(yǎng)基質(zhì)繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度20℃、濕度80%，每天通風(fēng)2次，上下午各一次，每次1 h～2 h，直至子實體成熟。采摘后檢測子實體中的蟲草素含量、蟲草粗多糖含量、麥角甾醇含量和纖溶酶酶活。

1.3.3 蛹蟲草活性物質(zhì)檢測

1.3.3.1 粗多糖含量的測定

粗多糖含量參照戚夢等[15]的方法進(jìn)行檢測。

1.3.3.2 蟲草素含量的測定

蟲草素含量參照NY/T 2116—2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定 高效液相色譜法》中的方法進(jìn)行檢測。

1.3.3.3 麥角甾醇含量的測定

麥角甾醇含量參照T/HZBX 026—2019《真菌及其制品中麥角甾醇的測定高效液相色譜法》中的方法進(jìn)行檢測。

1.3.3.4 纖溶酶酶活的測定

按料液比1∶2（g/mL），在菌絲共生體、子實體中分別加入適量去離子水，4℃靜止浸提6 h，6 000 r/min離心5 min，收集上清液。參考王明瑞等[2]的方法進(jìn)行纖溶酶酶活的測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用Excel和SPSS 20.0軟件，差異顯著性的分析采用單因素方差和最小顯著差（least significance difference test，LSD）檢驗法，顯著性水平設(shè)定為P＜0.05。作圖采用Origin 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草菌絲共生體中不同有效成分的影響

2.1.1 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲共生體粗多糖含量的影響

多糖是蟲草菌中的一種主要活性物質(zhì)，其合成過程與栽培原料成分差異、蛹蟲草發(fā)育階段、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝及途徑等有關(guān)[16-17]。不同培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草菌絲共生體粗多糖含量的影響見圖1。

圖1 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲共生體粗多糖含量的影響Fig.1 Effects of different medium on crude polysaccharide content of C.militias mycelial symbiote

由圖1可知，在相同試驗條件下，不同培養(yǎng)基質(zhì)上菌絲共生體的粗多糖含量不同，且差異顯著（P＜0.05）。其中，糜子培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)的菌絲共生體中粗多糖含量最高，為72.50 mg/g；油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)出的菌絲共生體中粗多糖含量最低，為21.93 mg/g；高粱培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)出的菌絲共生體中粗多糖含量為47.77 mg/g，介于糜子和油莎豆之間。常亞娜[18]通過對不同工藝條件下雜糧蛹蟲草菌質(zhì)成分的分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥仁和糙米質(zhì)量比為1∶2，并添加一定量大豆勻漿液和奶粉，光照時間27 d時，多糖含量可達(dá)68.02 mg/g，低于本研究的糜子培養(yǎng)基質(zhì)中粗多糖的含量。分析原因可能是不同培養(yǎng)基質(zhì)所含營養(yǎng)成分的種類、含量不同，可供蛹蟲草菌絲生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)也不同，而且不同來源的菌株合成多糖的過程可能也會不同，最終導(dǎo)致蛹蟲草菌質(zhì)蟲草粗多糖的含量各異。

2.1.2 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草菌絲共生體蟲草素含量的影響

蟲草素是蛹蟲草中特有的活性成分，有良好的應(yīng)用前景[18]。蟲草素的合成與蛹蟲草的生長基質(zhì)密切相關(guān)。不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲共生體蟲草素含量的影響見圖2。

圖2 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲共生體蟲草素含量的影響Fig.2 Effects of different medium on cordycepin content of C.militias mycelial symbiote

由圖2可知，在相同培養(yǎng)條件下，油莎豆蛹蟲草菌絲共生體中的蟲草素含量最高，為3.93 mg/g，糜子培養(yǎng)基中的蟲草素含量次之，為2.24 mg/g，高粱培養(yǎng)基中的含量最低，為1.09 mg/g。常正姣[19]以麥仁、糙米、大豆勻漿液和奶粉為培養(yǎng)基質(zhì)得出蟲草素含量為6.01 mg/g，略高于本研究油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)中蟲草素含量，分析原因可能是不同基質(zhì)來源和不同菌株影響了蛹蟲草菌絲體中蟲草素的合成。

2.1.3 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草菌絲共生體麥角甾醇含量的影響

影響食用菌中麥角甾醇含量的因素有很多，如遺傳因素、生長環(huán)境、生長基質(zhì)、生長時間、生長階段和菌種來源等[20]。不同培養(yǎng)基對蛹蟲草菌絲共生體麥角甾醇含量的影響見圖3。

圖3 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲共生體麥角甾醇含量的影響Fig.3 Effects of different medium on ergosterol content of C.militias mycelial symbiote

由圖3可知，在相同栽培條件下，菌絲共生體中的麥角甾醇含量受接種培養(yǎng)基質(zhì)的影響，且差異顯著（P＜0.05）。油莎豆蛹蟲草菌絲共生體的麥角甾醇含量最低，為0.39 mg/g，其次是糜子，為0.76 mg/g，在高粱培養(yǎng)基質(zhì)中含量最高可達(dá)1.38 mg/g，是油莎豆的3.54倍，推測可能是因為高粱的組成成分與糜子、油莎豆的成分不一致。

2.1.4 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草菌絲共生體纖溶酶酶活的影響

不同培養(yǎng)基對蛹蟲草菌絲共生體纖溶酶酶活的影響見圖4。

圖4 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對菌絲共生體纖溶酶酶活的影響Fig.4 Effects of different medium fibrinolyti enzyme activity of C.militias mycelial symbiote

由圖4可知，高粱和糜子培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲共生體的纖溶酶酶活分別為108.42 U/g和95.81 U/g，在油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)中最高，可達(dá)312.26 U/g，分別為高粱和糜子的2.88倍和3.26倍，這可能是因為油莎豆粒徑大，加大了與空氣的接觸面積，有效增加了發(fā)酵界面，有利于培養(yǎng)基質(zhì)的有效利用，促進(jìn)了纖溶酶的產(chǎn)生。

2.2 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體不同有效成分的影響

2.2.1 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體粗多糖含量的影響

多糖是評價蟲草產(chǎn)品優(yōu)良的一個重要指標(biāo)[21]，蛹蟲草子實體中合成多糖的能力因培養(yǎng)基的不同而不同。不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體粗多糖含量的影響見圖5。

圖5 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體粗多糖含量的影響Fig.5 Effects of different medium on crude polysaccharide content of C.militias fruiting bodies

由圖5可知，油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)上合成粗多糖的能力顯著高于糜子和高粱培養(yǎng)基質(zhì)，粗多糖含量分別為糜子和高粱培養(yǎng)基質(zhì)的1.82倍和2.96倍。研究發(fā)現(xiàn)，3種谷物培養(yǎng)基質(zhì)中，蛹蟲草子實體中的粗多糖含量均比菌絲共生體中的含量低。因此，糜子蛹蟲草菌絲共生體粗多糖具有良好的開發(fā)和應(yīng)用潛力，可用于普通人群或特殊人群的膳食替代。本結(jié)果與常亞娜[18]的研究觀點基本一致。

2.2.2 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體蟲草素含量的影響

不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體蟲草素含量的影響見圖6。

圖6 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體蟲草素含量的影響Fig.6 Effects of different medium on cordycepin content of C.militias fruiting bodies

由圖6可知，油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)的蟲草素含量最高，為7.34 mg/g，糜子培養(yǎng)基質(zhì)次之，為5.45 mg/g，高粱培養(yǎng)基質(zhì)最低，為4.33 mg/g，但均高于相應(yīng)培養(yǎng)基質(zhì)上的菌絲體中蟲草素含量。樂昕等[22]研究高粱米作為培養(yǎng)基質(zhì)的蛹蟲草子實體中，蟲草素含量為2.482 mg/g，低于本研究中蟲草素的含量，推測不同的菌種和培養(yǎng)條件可能會導(dǎo)致蛹蟲草子實體蟲草素含量上的差異。研究表明，子實體中蟲草素含量高于谷物蛹蟲草菌絲共生體，因此選擇油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)子實體體更有利于蟲草素的合成。

2.2.3 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體麥角甾醇含量的影響

不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體麥角甾醇含量的影響見圖7。

圖7 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體麥角甾醇含量的影響Fig.7 Effects of different medium on ergosterol content of C.militias fruiting bodies

由圖7可知，高粱培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)的子實體中的麥角甾醇含量最高，油莎豆最低，二者相差3.25 mg/g。子實體中麥角甾醇含量均高于相應(yīng)培養(yǎng)基質(zhì)上的菌絲共生體中麥角甾醇含量。結(jié)果表明，高粱培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)子實體最有利于麥角甾醇的合成。

2.2.4 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體纖溶酶酶活的影響

不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體纖溶酶酶活的影響見圖8。

圖8 不同谷物培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草子實體纖溶酶酶活的影響Fig.8 Effects of different medium on fibrinolyti enzyme activity of C.militias fruiting bodies

由圖8可知，油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)最有利于產(chǎn)纖溶酶，酶活可達(dá)140.1 U/g，其次為糜子培養(yǎng)基質(zhì)，然后是高粱培養(yǎng)基質(zhì)。相比菌絲共生體產(chǎn)纖溶酶的能力，油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)降低了55.13%，高粱培養(yǎng)基質(zhì)降低了32.18%，而糜子培養(yǎng)基質(zhì)僅降低了5.49%。研究表明，菌絲共生體中纖溶酶酶活高于子實體，油莎豆蛹蟲草菌絲共生體更有利于纖溶酶的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

本研究將液體菌種分別接至高粱、糜子、油莎豆3種谷物栽培培養(yǎng)基質(zhì)中，培育蛹蟲草產(chǎn)品，研究不同階段的指標(biāo)特征。結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基質(zhì)對蛹蟲草菌絲共生體和子實體的粗多糖、蟲草素、麥角甾醇和纖溶酶酶活均有影響。高粱培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)蛹蟲草子實體麥角甾醇含量最高，為6.10 mg/g，是菌絲共生體的4.42倍；糜子培養(yǎng)基質(zhì)培養(yǎng)的菌絲共生體粗多糖含量最高，為72.50 mg/g；油莎豆培養(yǎng)基質(zhì)中菌絲共生體產(chǎn)纖溶酶酶活最高，為312.26 U/g，子實體蟲草素含量最高，為7.34 mg/g。因此，高粱適合作為培養(yǎng)高產(chǎn)麥角甾醇的蛹蟲草子實體的培養(yǎng)基質(zhì)，糜子可作為培養(yǎng)高產(chǎn)粗多糖的菌絲共生體的培養(yǎng)基質(zhì)，油莎豆可作為高產(chǎn)蟲草素的子實體和高產(chǎn)纖溶酶的菌絲共生體的培養(yǎng)基質(zhì)。

總之，蛹蟲草的各種活性成分與所用培養(yǎng)基質(zhì)、菌株來源等多種因素相關(guān)。選擇適宜的培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)含有特定有效成分的蛹蟲草產(chǎn)品，可為開發(fā)多種具有不同主體功能的谷物蛹蟲草食品提供依據(jù)。