一測(cè)多評(píng)法測(cè)定姜汁紅糖中的6種姜辣素類成分含量

陳其釗，陳紅香*，陳嘉敏，王桂華，李家威，余構(gòu)彬

(1.廣東省科學(xué)院生物工程研究所，廣州 510316；2.國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，廣州 510316)

姜汁紅糖是以紅糖為原料，添加姜汁、姜粉加工而成的食糖[1]。中醫(yī)營(yíng)養(yǎng)學(xué)認(rèn)為，性溫的紅糖通過“溫而補(bǔ)之，溫而通之，溫而散之”[2-3]來發(fā)揮補(bǔ)血作用，生姜?jiǎng)t具有解表散寒、溫中止嘔、溫肺止咳、解毒的功效，常用于風(fēng)寒感冒、脾胃寒癥、胃寒嘔吐、肺寒咳嗽、解魚蟹毒[4]。民間素有“男子不可百日無姜，女子不可百日無糖”[5-6]之說。用生姜、紅糖熬制的姜湯可活血驅(qū)寒，防治感冒，自古就是風(fēng)寒感冒時(shí)的食療良藥。

目前市面上有關(guān)姜汁紅糖的產(chǎn)品非常多，但是并沒有相關(guān)產(chǎn)品的國家標(biāo)準(zhǔn)。輕工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 5006-2016雖然規(guī)定了姜汁紅糖的各項(xiàng)指標(biāo)，但并不具有強(qiáng)制性，市面上幾乎所有的產(chǎn)品都是執(zhí)行GB/T 29602-2013[7]《固體飲料》或者自己的企標(biāo)。以至于我們?cè)谇捌谡{(diào)查中發(fā)現(xiàn)，各家產(chǎn)品在生姜的添加量上參差不齊。

姜汁紅糖中的主要成分為蔗糖和姜辣素。常見的姜辣素成分有6種，目前2020版《中國藥典》只規(guī)定6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚作為生姜質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)成分，并不夠全面。GB/T 22293—2008[8]中利用校正因子法測(cè)定了6種成分，但是其中的峰定位十分模糊，分離不理想，干擾大，耐用性等也不明確。

然而目前尚未見將姜醇和姜酚主要活性成分共同作為姜汁紅糖質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)的文獻(xiàn)報(bào)道。故本研究建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)分析了不同產(chǎn)品的姜醇和姜酚含量，擬將生姜主要特征性活性成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚共同作為其質(zhì)量控制指標(biāo)成分，更加全面地評(píng)價(jià)姜汁紅糖的質(zhì)量，便于企業(yè)、機(jī)構(gòu)執(zhí)行利用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

Aglient 1260、1260II高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；LC-20AT高效液相色譜儀 日本島津公司；VORTEX 3渦旋混合器 艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司；CL5R醫(yī)用離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Milli-Q超純水系統(tǒng) 默克密理博公司；色譜柱 Ecosil C18-Eco100A C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 廣州綠百草生物科技有限公司；Mycotox C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) Pickering公司；ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm) 安捷倫公司；中譜紅RD-C18柱(4.6 mm×150 mm, 5 μm) 中譜科技公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈(色譜純)：西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；冰乙酸、甲酸、磷酸(分析純)：廣州化學(xué)試劑有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚(純度≥98%)：成都普菲德生物技術(shù)有限公司；合成辣椒素(純度99.5%)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

9批次姜汁紅糖樣品均購于大型超市,見表1。在分析之前，所有食糖樣品都儲(chǔ)存在塑料罐中陰涼避光保存。

表1 姜汁紅糖樣品來源Table 1 The source of brown sugar ginger juice samples

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil C18-Eco100A C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：(A)1%冰乙酸、(B)乙腈，梯度洗脫：0～15.0 min，52.0% A；15.0～17.0 min，52.0% A→40.0% A；17.0～43.0 min，40.0% A→20.0% A；43.0～43.01 min，20.0% A→52.0% A；43.01～50.0 min，52.0% A。

2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱量1.00 g姜糖用適量甲醇溶解，渦旋1 min后超聲30 min，用甲醇定容到10 mL。搖勻，以0.22 μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別精密稱取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚及合成辣椒素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇溶解后分別定容至100 mL，即得各標(biāo)準(zhǔn)品濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中保存。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：從各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別取適量混合，渦旋混勻，用甲醇稀釋成濃度為2～50 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以作線性范圍考察及含量測(cè)定使用。

2.4 陰性對(duì)照溶液

使用不含生姜的紅糖作為陰性對(duì)照樣品，再按照2.2的方法制成對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照溶液。

2.5 色譜條件優(yōu)化

2.5.1 提取方法選擇

6種姜辣素成分可溶于無水乙醇和甲醇，同時(shí)避免樣品中蔗糖含量太高的干擾。但是無水乙醇的截止波長(zhǎng)較高，作為溶劑時(shí)，基線漂移較大，而甲醇作為提取溶劑基線相對(duì)平滑。由于姜辣素是熱不穩(wěn)定的酚類化合物，在較高溫度下容易受到破壞而損失，若考慮姜辣素的品質(zhì)和提取率，則超聲波輔助法為最佳提取方法[9-10]。姜汁紅糖中除了蔗糖、姜辣素外，還有色素[11-12]、甾醇[13-14]、黃酮多酚類[15-17]、有機(jī)酸[18]等。本研究中考慮到回收率并未選擇凈化方法，因此需要較長(zhǎng)的梯度洗脫來實(shí)現(xiàn)分離、排除干擾。

2.5.2 流動(dòng)相選擇

以2020版《中國藥典》以及國家標(biāo)準(zhǔn)(見表2)為參考，本實(shí)驗(yàn)分別嘗試了1%乙酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-甲醇+乙腈(1+1)、甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)在乙腈+酸水條件下，能實(shí)現(xiàn)7種成分的分離。在甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)，7種成分會(huì)出現(xiàn)峰形拖尾或重疊的情況。而在甲醇-酸水系統(tǒng)下，完全出峰時(shí)間則超過60 min，顯得過長(zhǎng)。所以，選擇1%乙酸-乙腈作為流動(dòng)相。

表2 藥典及標(biāo)準(zhǔn)中姜辣素的研究情況Table 2 Study on gingerols in pharmacopoeia and standard

2.5.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

在190～400 nm波長(zhǎng)下分別對(duì)7種成分標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行紫外掃描，發(fā)現(xiàn)在230 nm和280 nm處均有較強(qiáng)吸收，但是經(jīng)過測(cè)試，在230 nm處各成分響應(yīng)一般，280 nm處響應(yīng)高，雜質(zhì)也相對(duì)較少。所以，選擇280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性考察

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與姜汁紅糖提取液的色譜圖見圖2。通過比對(duì)，鑒別出姜汁紅糖中6種姜辣素成分，峰位見圖2標(biāo)注，各定量峰分離良好，無明顯干擾。

2.6.2 線性與范圍

精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液一定體積，按倍數(shù)關(guān)系稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，采用優(yōu)化后的前處理方法以及色譜條件，以7種成分色譜峰的峰面積平均值(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以信噪比S/N=3確定儀器檢出限(LOD)，結(jié)果見表3。

表3 7種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限Table 3 Standard curves, linear ranges and detection limitsof 7 components

7種成分在各自濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999；6-姜酚檢出限為5.56 mg/kg，8-姜酚為8.77 mg/kg，10-姜酚為7.81 mg/kg，6-姜烯酚為7.11 mg/kg，8-姜烯酚為9.43 mg/kg，10-姜烯酚為8.57 mg/kg，合成辣椒素為8.33 mg/kg。該方法靈敏度較高，可滿足糖品中姜辣素檢測(cè)的需要。

2.6.3 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液按照2.1的方法，在色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣8次，結(jié)果見表4。6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚、合成辣椒素峰面積的RSD分別為1.40%、0.71%、0.92%、2.30%、1.80%、0.71%、0.72%，表明儀器的精密度良好。

表4 儀器精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Precision test results of instruments

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照2.2的樣品處理方法制備空白加標(biāo)(5 mg/L)1份，冷藏條件(2～4 ℃)下放置，分別于0，1，3，6，9，12，24 h取出，按照2.1的方法考察其穩(wěn)定性。結(jié)果表明，在冷藏條件下放置24 h更穩(wěn)定，見表5。

表5 24 h穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(2～4 ℃下避光放置)Table 5 24 h stability test results (place away from light at 2～4 ℃)

2.6.5 回收率試驗(yàn)

精確稱取紅糖樣品1.00 g，分別加入3個(gè)水平的對(duì)照品，在最佳提取條件及色譜條件下，每一濃度平行3次測(cè)定紅糖中姜辣素的回收率，結(jié)果見表6。紅糖中6-姜酚的平均回收率為95.8%～104.4%，8-姜酚的平均回收率為89.8%～103.0%，6-姜烯酚的平均回收率為88.2%～102.2%，10-姜酚的平均回收率為94.6%～105.3%，8-姜烯酚的平均回收率為130.0%～134.3%，10-姜烯酚的平均回收率為80.9%～90.8%。

表6 回收率試驗(yàn)結(jié)果(0 ℃下避光放置)Table 6 Recovery rate test results (place away from light at 0 ℃)

2.7 校正因子的計(jì)算

精密吸取2.3項(xiàng)下制備的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，依法進(jìn)樣測(cè)定各成分的峰面積，以合成辣椒素為參照物，計(jì)算其他6種成分的相對(duì)校正因子k/s，公式為k/s=k/s=(CkAs)/(CsAk)，其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為參照物含量，As為參照物峰面積，結(jié)果見表7。

表 7 姜汁紅糖中7種成分相對(duì)校正因子Table 7 Relative correction factors of 7 components in brown sugar ginger juice

2.8 不同儀器、不同色譜柱對(duì)校正因子的影響

對(duì)比考察3臺(tái)高效液相色譜儀及4種色譜柱對(duì)6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚校正因子的影響，結(jié)果顯示6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚校正因子的RSD分別為1.64%、3.53%、3.83%、3.89%、6.05%、4.51%，表明不同儀器、不同色譜柱對(duì)校正因子影響較小，結(jié)果見表8。

表8 不同儀器、 不同色譜柱對(duì)校正因子的影響Table 8 Effect of different instruments and chromatographic columns on correction factors

2.9 不同流速的耐用性驗(yàn)證

取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，按照2.1的方法，分別考察流速為0.7，1.0，1.5 mL/min下，以合成辣椒素作為參照成分時(shí)其他6種成分的相對(duì)校正因子，考察流速波動(dòng)對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果表明各相對(duì)校正因子RSD在0.66%～4.58%，說明相對(duì)校正因子在流速波動(dòng)變化0.7～1.5 mL/min范圍內(nèi)耐用性良好，結(jié)果見表9。

表9 不同流速對(duì)相對(duì)校正因子的影響Table 9 Effect of different flow rates on relative correction factors

2.10 不同柱溫的耐用性驗(yàn)證

取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，按照2.1的方法，分別考察柱溫為30，35，40 ℃下，以合成辣椒素作為參照成分時(shí)其他6種成分的相對(duì)校正因子，考察柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果表明各相對(duì)校正因子RSD在0.09%～8.85%，說明相對(duì)校正因子在柱溫波動(dòng)變化5 ℃范圍內(nèi)耐用性良好，結(jié)果見表10。

表10 不同柱溫對(duì)相對(duì)校正因子的影響Table 10 Effect of different column temperatures on relative correction factors

2.11 不同pH值的耐用性驗(yàn)證

取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣，按照2.1的方法，分別考察流動(dòng)相pH值分別為1.5，2.6，3.5，以合成辣椒素作為參照成分時(shí)其他6種成分的相對(duì)校正因子，考察流動(dòng)相pH值對(duì)相對(duì)校正因子的影響。結(jié)果表明各相對(duì)校正因子RSD在0.25%～5.13%，說明相對(duì)校正因子在不同pH值溶液中適應(yīng)性良好，結(jié)果見表11。

表11 流動(dòng)相pH值對(duì)相對(duì)校正因子的影響Table 11 Effect of mobile phase pH values on relative correction factors

2.12 待測(cè)成分色譜峰的定位

本文以合成辣椒素為內(nèi)標(biāo)色譜峰，考察3臺(tái)高效液相色譜儀及4種色譜柱條件下，待測(cè)成分6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間值， 結(jié)果顯示6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚、10-姜烯酚相對(duì)保留時(shí)間值的RSD分別為0.97%、3.46%、4.30%、2.25%、4.83%和3.78%，表明不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間值無顯著影響，結(jié)果見表12。

表12 不同儀器、不同色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間值的影響Table 12 Effect of different instruments and chromatographic columns on relative retention time value

續(xù) 表

2.13 QAMS法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果的比較

取表1中的姜汁紅糖樣品，按照2.2的方法，每個(gè)樣品平行制備3份供試品溶液，分別采用一測(cè)多評(píng)法和外標(biāo)法測(cè)定姜汁紅糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的含量，結(jié)果見表13。采用SPSS 25軟件，對(duì)外標(biāo)法與QAMS法測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示P>0.05，表明兩種方法測(cè)定值之間無顯著差異。

表13 含量測(cè)定結(jié)果(n=3，g/100 g)Table 13 Results of content determination (n=3,g/100 g)

3 結(jié)論

本研究以合成辣椒素為參照物，建立了姜汁紅糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的QAMS定量方法。該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及耐用性較好，均符合分析要求。采用該方法檢測(cè)了9批姜汁紅糖中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚、8-姜烯酚和10-姜烯酚的含量，t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示：該方法與外標(biāo)法得到的含量值基本一致，說明以合成辣椒素為參照物的QAMS法可準(zhǔn)確對(duì)6種姜辣素成分進(jìn)行定量測(cè)定。本研究結(jié)果可為姜汁紅糖的質(zhì)量控制與質(zhì)量評(píng)價(jià)提供新思路和參考。