膜過濾泡菜汁生物膜污染的初步分析

王玉梅，李洋，羅佳沂，栗曉靜，李文，毛瑞豐*

(1.廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004；2.廣西民族大學 化學化工學院廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，南寧 530006)

泡菜是自然接種混合發(fā)酵的果蔬發(fā)酵制品[1]。泡菜汁中含有多種微生物[2]且化學成分復雜[3]，經(jīng)過處理后可以作為泡菜型產(chǎn)品的風味劑、泡菜汁飲品、泡菜風味產(chǎn)品原料。泡菜汁的開發(fā)利用是解決泡菜生產(chǎn)產(chǎn)生的廢水污染問題的重要途徑。

隨著膜技術(shù)的發(fā)展，膜過濾因具有低能耗、方便、效率高、無污染等優(yōu)勢在食品行業(yè)應用越來越廣泛[4]。但在膜過濾使用過程中，膜污染仍然是一個很難避免的問題。膜污染又分為生物污染、有機物污染、無機物污染及物料原有物質(zhì)(膠體污染)4種類型[5]。其中，有機物污染、無機物污染及物料原有物質(zhì)(膠體污染)能通過一定的手段處理[6-7]，但生物污染不僅會加速膜不可逆污染，且微生物會附著在膜表面，隨著膜設(shè)備的運行，微生物的胞外聚合物(EPS)[8]、微生物活/死菌體[9]、膠體物質(zhì)等會形成生物膜，增加能耗，降低膜通量，縮短膜的使用壽命。因此，在膜過濾泡菜汁的過程中，微生物對膜的污染問題不容小覷，當堆積到一定厚度時，甚至會導致陶瓷膜報廢。

膜過濾泡菜汁15 h內(nèi)，通過測定膜通量、微生物的截留率、污染膜上微生物的分離鑒定、污染膜形貌的觀察、EPS含量的變化、污染膜官能團分析等分析了膜生物污染的情況，為后續(xù)膜過濾泡菜汁中膜生物污染控制及清洗提供了理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗原料

泡菜汁：由廣西某泡菜廠提供。取得的泡菜汁經(jīng)8層滅菌紗布過濾之后即可作為膜處理的原料液。

1.2 實驗設(shè)備

陶瓷膜中試設(shè)備。

1.3 實驗方法

1.3.1 膜通量的測定

選用0.05 μm孔徑陶瓷膜管過濾泡菜汁，在TMP=0.35 MPa， TEM=35 ℃， CFV=4～5 m/s的條件下， 測定膜過濾泡菜汁15 h內(nèi)膜通量變化情況。膜通量的計算公式：

式中：J為膜滲透通量(L/(m2·h))；V為滲透液體積(L)；A為膜過濾面積；t為滲透液所需的時間(h)。

1.3.2 泡菜汁菌落總數(shù)的測定

測定不同時間(1，3，6，9，12，15 h)內(nèi)，經(jīng)陶瓷膜過濾后泡菜汁微生物菌落總數(shù)的變化情況。泡菜汁中細菌的菌落總數(shù)參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》進行測定。泡菜汁中真菌的菌落總數(shù)參照GB 4789.15-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》進行測定。

1.3.3 陶瓷膜管污染微生物的分離鑒定

1.3.3.1 細菌和真菌的分離純化

測定不同時間(1，3，6，9，12，15 h)內(nèi)，膜過濾后泡菜汁引起膜管污染微生物的分離鑒定。取3 mL經(jīng)膜過濾泡菜汁及原泡菜汁樣品于無菌平板中，用平板傾注法分別倒NA、PDA平板。待平板凝固后，NA平板倒置放在37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，PDA平板倒置放在28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，然后對平板內(nèi)的細菌和真菌菌株進行分離純化，分離純化方法采用平板劃線法，直到獲得純化的單菌落保存于-20 ℃冰箱中。

1.3.3.2 DNA的提取及PCR擴增

將分離的細菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 h，參考細菌DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，將分離的真菌于PDB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，參考真菌DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。PCR擴增采用50 μL反應體系：

細菌擴增引物：27F/1492R 27F：5′-AGAGTTTGA

TCCTGGCTCAG-3′；1492R：5′-TACGGCTACCTTG

TTACGACTT-3′。

真菌擴增引物：ITS1/ITS4 ITS1：5′-TCCGTAGGT

GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGAT

ATGC-3′。

PCR擴增程序見表1，PCR反應條件見表2。

表1 PCR擴增程序Table 1 PCR amplification procedure

表2 PCR反應條件Table 2 PCR reaction conditions

1.3.3.3 DNA與PCR擴增產(chǎn)物的保存方法

DNA與PCR產(chǎn)物分別放置在滅菌的1.5 mL的離心管和PCR管中密封，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.4 DNA測序及序列相似性對比

對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，獲得清晰明亮的條帶， PCR產(chǎn)物測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

16S rRNA和ITS序列分析：序列分析登錄NCBI數(shù)據(jù)庫，應用BLAST程序分別對所測得的16S rRNA和ITS序列與GenBank中的核酸進行相似性比對。利用MEGA 7.0軟件[10]計算序列的堿基組成(compute nucleotide composition)[11]，計算遺傳距離[12]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]，檢驗各分支的置信度[14]。遺傳距離基于Kimura 2-parameter模式計算，系統(tǒng)發(fā)育樹基于Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建，各分支的置信度利用自展法(Bootstrap重復1000次)檢驗。

1.3.4 污染膜顯微結(jié)構(gòu)

將污染膜管脆斷并獲取其橫斷面和表面的樣品，參考王賀[15]的方法，并稍作修改。

藍寶石英文名稱為Sapphire，源于拉丁文Spphins，意思是藍色。象征著穩(wěn)健、端莊和聰慧。自古以來，人們迷醉于藍寶石內(nèi)所蘊含的安靜和強烈的力量。據(jù)說，藍寶石是距離神靈最近的寶石，它湛藍的顏色在任何時候都不會改變，甚至影響到藍色天空的形成。

1.3.5 泡菜汁中胞外聚合物分布及組成測定

泡菜汁中胞外聚合物分布及組成的測定參考王賀的方法并稍作修改。蛋白含量以牛血清白蛋白(BSA)為標樣，采用考馬斯亮藍法測定[16]。多糖含量以葡萄糖為標樣，采用蒽酮硫酸法測定[17]。

1.3.6 污染的膜傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜分析

將已被污染的陶瓷膜脆斷并研磨成粉末，冷凍干燥后，再與烘干至恒重的溴化鉀按一定的比例充分混合研磨均勻，真空壓片后采用傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜儀(FTIR)，掃描范圍為400～4000 cm-1，掃描次數(shù)64次，對污染膜官能團進行分析。

1.4 實驗數(shù)據(jù)分析

原始實驗數(shù)據(jù)處理采用Excel及SPSS 26軟件，每組實驗重復3次，實驗數(shù)據(jù)采用Origin 2019b軟件進行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 膜過濾泡菜汁不同過濾時間的膜通量分析

膜設(shè)備本身和膜過濾泡菜汁工藝成本是影響陶瓷膜過濾泡菜汁工藝中的一項重要指標，膜過濾泡菜汁15 h內(nèi)，膜通量隨時間的變化結(jié)果見圖1。

圖1 膜過濾泡菜汁膜通量隨時間的變化Fig.1 The changes of membrane flux of pickle juice by membrane filtration with time

由圖1可知，隨著膜過濾泡菜汁時間的延長，膜通量下降，且膜通量從開始過濾到過濾300 min的階段下降速度較快，而在300～900 min之間膜通量的下降速度較300 min之前慢。究其原因可能是在過濾初期，泡菜汁含有分子粒徑大小與平均孔徑為0.05 μm的陶瓷膜相似的物質(zhì)，在高跨膜壓差的驅(qū)動下，進入到膜孔內(nèi)進而阻塞膜孔或堆積到膜表面的“溝壑”處，且粒徑大小與膜孔徑相似的雜質(zhì)含量越多，最終導致膜通量下降速度越快。膜污染到一定程度后，隨著過濾時間的延長，膜通量下降較緩慢，原因可能是即使在較高的跨膜壓差條件下，膜面的濃差極化程度也相差較小。

2.2 膜過濾泡菜汁不同過濾時間的微生物菌落總數(shù)變化

微生物的截留率也是評價陶瓷膜過濾泡菜汁效果的因素之一，0.05 μm陶瓷膜過濾泡菜汁除菌率隨時間的變化結(jié)果見圖2。

由圖2可知，原泡菜汁中細菌、乳酸菌、真菌的菌落總數(shù)分別降低為55000，673500，3705 CFU/mL；膜處理起始階段，泡菜汁中細菌、乳酸菌、真菌的菌落總數(shù)分別為75，240，6 CFU/mL，細菌、乳酸菌、真菌的去除率分別為99.96%、99.96%、99.99%, 3，6，9，12，15 h與1 h相比泡菜汁中細菌的截留率分別降低為0.0008%、0.01%、0.017%、0.03%、0.04%；泡菜汁中乳酸菌的截留率分別降低為0.010%、0.012%、0.018%、0.027%、0.04%；泡菜汁中真菌的截留率分別降低為0.005%、0.007%、0.011%、0.013%、0.0133%。由此可知，0.05 μm陶瓷膜過濾泡菜汁，隨著過濾時間的延長，膜過濾除菌率降低，隨著膜污染程度的加深，陶瓷膜過濾泡菜汁的除菌效果也隨之降低。

2.3 泡菜汁過濾中膜污染微生物的分離鑒定

從污染的陶瓷膜中分別分離出細菌和真菌16株和5株，最終選取9株細菌及4株真菌的DNA為模板，細菌以27F和1492R為引物進行16S rRNA擴增，真菌以ITS1和ITS4為引物進行ITS擴增，并將得到的PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，見圖3。

圖3 PCR擴增紫外凝聚成像圖Fig.3 UV agglutination images amplified by PCR

由圖3 可知，9株細菌及4株真菌的擴增產(chǎn)物都是條帶明亮清晰且單一不拖尾，無非特異擴增現(xiàn)象，且細菌菌株的16S rRNA序列片段大小均在1200～1400 bp左右，真菌菌株的ITS序列片段大小均在500～700 bp左右，滿足測序要求。

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

將9株細菌和4株真菌采用GenBank序列數(shù)據(jù)庫在NCBI上根據(jù)BLAST檢索搜索與上述所測得序列相似度較高的16S rRNA和ITS序列，分析比較后刪除相同的序列，最終篩選最相似的16S rRNA和ITS序列與供試菌株的序列采用NJ法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

細菌結(jié)果見圖4。

圖4 基于16S rRNA序列的9株細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 9 strains of bacteria based on 16S rRNA sequence

由圖4可知，細菌的NJ系統(tǒng)進化樹各主分支的自舉支持率范圍在67%～100%，且各主分支的后驗概率大部分在0.90～1.0之間。最終將9株供試菌株歸為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)、放線菌(Actinobacteriabacterium)、馬賽短芽孢桿菌(Brevibacillusmassiliensis)、絲狀芽孢桿菌(Bacillusfilamentosus)、堅強芽孢桿菌(Bacillusfirmus)、發(fā)酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)及乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)。

真菌結(jié)果見圖5。

圖5 基于ITS序列的4株真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 4 strains of fungi based on ITS sequence

由圖5可知，真菌的NJ系統(tǒng)進化樹各主分支的自舉支持率在100%，且各主分支的后驗概率大部分在0.95～1.0之間。最終將4株供試菌株歸為卡尼克酵母菌(Sporobolomycescarnicolor)和庫德里阿茲威畢赤酵母菌(Pichiakudriavzevii)。

2.4 膜過濾泡菜汁不同過濾時間的污染膜SEM分析

泡菜汁膜過濾不同時間(新膜、3，6，9，12，15 h)，取不同過濾時間下獲得的膜管進行SEM分析，結(jié)果見圖6和圖7。被污染的膜表面無明顯的結(jié)垢，但膜內(nèi)表面呈淺淺的黃色，與膜過濾后的泡菜汁顏色相似，推測可能是泡菜汁中的色素部分被截留到膜表面。采用SEM觀察泡菜汁膜過濾不同時間內(nèi)膜被污染的情況。

新的陶瓷膜及不同過濾時間陶瓷膜橫斷面的SEM圖見圖6中A～F。由圖6中A可知，新的陶瓷膜的橫斷面中會有部分微小顆粒，可能是在脆斷過程中膜管本身材料抖落所致。0.05 μm的陶瓷膜內(nèi)為非均勻結(jié)構(gòu)，且最大孔徑為0.42 μm，因此泡菜汁中的小分子物質(zhì)以及部分粒徑小于0.42 μm的物質(zhì)能夠透過陶瓷膜；范圍在0.05～0.42 μm的小分子物質(zhì)被截留或吸附在膜孔內(nèi)，堵塞膜孔造成膜污染；而被截留的物質(zhì)粒徑大于0.42 μm。由圖6中B～F可知，隨著過濾的進行，新膜和污染膜表面有明顯的區(qū)別，泡菜汁中的小分子物質(zhì)或懸浮物明顯吸附或沉積在膜表面以及膜孔內(nèi)，致使膜橫斷面孔徑堵塞越來越嚴重，且時間越長，橫斷膜面堆積的雜質(zhì)越多。

新的陶瓷膜及不同過濾時間陶瓷膜內(nèi)膜表面的SEM圖見圖7中A～F。由圖7中A可知，新的陶瓷膜內(nèi)膜表面由非均勻、隨機分布的微粒任意堆積而成，陶瓷膜的孔徑就是由于微粒與微粒之間的非緊密結(jié)合形成的。由圖7中B可知，陶瓷膜過濾泡菜汁運行3 h后的污染膜孔徑表面覆蓋著少量的污染物，且在膜孔隙中有疑似橢圓形及桿狀的微生物。運行6，9，12，15 h后的污染膜管上也均有此現(xiàn)象出現(xiàn)，且陶瓷膜過濾泡菜汁運行時間越長，膜表面的污染物質(zhì)就越多，膜面污染越嚴重。運行15 h后的陶瓷膜結(jié)果見圖7中F，雖然膜表面覆蓋著許多的污染物，但仍然能發(fā)現(xiàn)膜孔的存在，說明陶瓷膜過濾泡菜汁運行15 h后的膜污染還未形成濾餅層污染，主要的污染形式仍為膜孔內(nèi)污染。

2.5 泡菜汁過濾中膜污染官能團分析

采用FTIR光譜儀分析泡菜汁陶瓷膜過濾中被污染陶瓷膜的官能團，結(jié)果見圖8。

圖8 不同運行時間后陶瓷膜傅里葉紅外光譜Fig.8 FTIR spectra of ceramic membrane after different operation time

結(jié)果顯示：FTIR光譜儀分析表明陶瓷膜過濾泡菜汁中，引起膜污染的主要物質(zhì)有蛋白質(zhì)、多糖、泡菜汁中的酚類物質(zhì)以及少量脂類化合物。

2.6 膜過濾時間對泡菜汁中胞外聚合物含量的影響

泡菜汁膜過濾不同時間(1，3，6，9，12，15 h)，泡菜汁中EPS含量分析結(jié)果見圖9。

圖9 泡菜汁中蛋白含量隨時間的變化Fig.9 The changes of protein content in pickle juice with time

由圖9可知，原泡菜汁中EPS含量為13.73 mg/mL，經(jīng)膜處理后，泡菜汁中EPS含量顯著下降。膜過濾3，6，9，12，15 h后泡菜中EPS分別增加了1.28%、9.09%、10.28%、19.56%、25.15%，其中SEPS含量分別增加了7.80%、18.44%、24.67%、84.47%、97.79%；TB-EPS含量分別增加了16.95%、20.39%、25.14%、30.06%、55.17%；LB-EPS含量分別增加了10.14%、18.12%、27.42%、36.48%、44.75%。由此可知，隨著膜過濾的進行，結(jié)合態(tài)EPS含量大于SEPS含量，且泡菜汁中疏水性大分子芳香族蛋白質(zhì)主要在TB-EPS中，LB-EPS中主要是小分子的有機酸[25]。隨著過濾的進行，泡菜汁中EPS含量增加，由于EPS的雙層結(jié)構(gòu)將微生物包裹起來，能夠在極端的條件下對泡菜汁中的微生物起到良好的保護作用；泡菜汁中的蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)被截留，不僅為微生物的生長代謝提供了營養(yǎng)物質(zhì)，而且EPS的組成及成分比例差異被附著在微生物及其微生物絮凝物表面，因此會對微生物及其微生物絮凝物表面的親水性和疏水性等特性產(chǎn)生不同程度的影響[26-27]，這些均能促使膜通量降低，膜污染越來越嚴重。

3 結(jié)論

0.05 μm孔徑膜在最適條件下過濾泡菜汁，膜運行至15 h時，膜通量降低43.49%；微生物截留率降低0.4%；從污染膜管上檢出的微生物細菌主要是芽孢桿菌、放線菌和乳桿菌；真菌為卡尼克酵母菌和庫德里阿茲威畢赤酵母菌。膜孔內(nèi)和膜內(nèi)表面污染，膜運行時間越長，膜管污染越嚴重。引起膜污染的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)、多糖、泡菜汁中的酚類物質(zhì)以及少量脂類化合物。運行15 h時，EPS含量增加25.15%。膜過濾泡菜汁連續(xù)運行15 h，若不及時清洗，不僅過濾效果低，甚至會造成膜管報廢，增加生產(chǎn)成本。因此，膜過濾泡菜汁的最適周期為15 h。