響應面法優(yōu)化松茸蛋白的提取工藝

賴雨微，張倩，高俊鵬，劉翔，王剛，陳光，李艷麗*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學秸稈生物學與利用教育部重點實驗室，長春 130118；2.武漢森瀾生物技術有限公司，武漢 430120)

松茸(Tricholomamatsutake)，又名松口蘑、松菇、松菌、松蘑、合菌、大花菌、剝皮菌等[1]，位于中國“四大名菌”之首，享有“菌中之王”的美譽[2]。松茸是松櫟等樹木外生的菌根真菌，研究表明，松茸具有抗腫瘤、抗輻射、美白、抗氧化、預防糖尿病以及增強免疫力等營養(yǎng)和藥用價值[3-5]，目前松茸子實體在亞洲和北歐均具有重要的商業(yè)價值[6]。在我國，松茸主要分布在東北、四川、云南等地，隨著近年來研究的深入，美洲、歐洲和北美洲等地也相繼有報道[7]。松茸含有蛋白、多糖、萜類、皂苷等多種物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量明顯優(yōu)于其他食用菌，新鮮松茸中的粗蛋白含量可以達到20.07%，其中純蛋白含量在8.8%～10%；烘干后松茸中的蛋白質(zhì)含量也在13%，松茸中含有17種氨基酸和多種維生素，此外，松茸水解后的產(chǎn)物具有促進健康和改善生物體機能的功效[8]。

目前生物體獲取的蛋白質(zhì)來源于動物、植物和食用菌中[9]。而動物源蛋白質(zhì)的開發(fā)周期長且在生產(chǎn)過程中會導致溫室氣體的排放[10]，食用后也可能造成心腦血管疾病等健康風險[11]。而植物源蛋白中往往必需氨基酸受限，比如豆類蛋白含硫氨基酸含量較低，谷類蛋白賴氨酸含量較低[12]，限制了其營養(yǎng)學價值。而食用菌中蛋白含量豐富[13]，與動、植物源蛋白質(zhì)相比，具有更高的營養(yǎng)價值和安全性[14-15]。研究表明松茸菌絲體可以體外培養(yǎng)，有望進行半人工栽培[16-18]，相信隨著生物技術的逐步發(fā)展，松茸的人工栽培技術終將實現(xiàn)。這些特性都將為松茸開發(fā)成為功能性食品配料提供理論依據(jù)。因此，將松茸中的功能性物質(zhì)充分開發(fā)與利用勢在必行。

國內(nèi)外對于松茸蛋白提取的研究較少，主要集中在對松茸菌絲體中多糖或糖蛋白的提取以及其生物活性的研究，且利用超聲輔助堿提優(yōu)化松茸蛋白提取條件的研究尚未見報道。因此，本試驗采用超聲輔助堿提法對松茸蛋白進行提取，結合單因素試驗進行Box-Behnken試驗設計，對堿提松茸蛋白的工藝進行超聲輔助優(yōu)化，并在不同的pH下對松茸蛋白的功能性質(zhì)進行測定，為松茸蛋白的提取和進一步綜合開發(fā)利用提供了理論依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生新鮮松茸子實體、大豆油：市售；牛血清白蛋白：福州飛凈生物科技有限公司；鹽酸、氫氧化鈉：均為分析純，北京化工廠；硫酸銨：國藥集團化學試劑有限公司。

SIN415-2903型酶標儀 Omega公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設備有限公司；TG2-16B型離心機 上海安亭科學儀器廠；Kjeltee-8400型全自動凱氏定氮儀 丹麥福斯分析儀器有限公司；KQ-250DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品預處理

將新鮮松茸清洗后切片陰干，于烘箱中50～60 ℃烘干至恒重，通風冷卻后粉碎過70目篩，得松茸干粉，置于干燥環(huán)境下密封保存。

1.2.2 松茸蛋白的提取

1.2.2.1 堿提法提取松茸蛋白

經(jīng)1.2.1處理的松茸蛋白，按照一定的固液比在一定pH下進行堿提，保持恒定溫度提取一定時間，反應結束后以10000 r/min離心20 min，收集上清液，采用考馬斯亮藍G250法測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2.2 超聲輔助堿提法優(yōu)化松茸蛋白提取工藝

在堿提法提取的基礎上，優(yōu)化超聲輔助提取松茸蛋白的條件，調(diào)節(jié)一定固液比的反應溶液pH，在固定超聲功率200 W下超聲提取一段時間后，在恒溫下提取一定時間，反應結束后以10000 r/min離心20 min，收集上清液采用考馬斯亮藍G250法[19]測定提取液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.3 松茸蛋白質(zhì)含量的測定

1.2.3.1 標準曲線的繪制

配制100 mg/mL的牛血清白蛋白標準溶液，分別稀釋到不同濃度，采用考馬斯亮藍G250法測定OD595處的吸光度，以蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3.2 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定

參照考馬斯亮藍G250法測定樣品溶液在OD595處的吸光值，根據(jù)標準曲線計算樣品中松茸蛋白質(zhì)量濃度，按下式計算蛋白質(zhì)的提取率。

1.3 松茸蛋白堿提取的單因素試驗

松茸干粉→不同pH的堿液(用0.20 mol/L NaOH調(diào)節(jié)堿提液pH)→調(diào)節(jié)堿提溫度→穩(wěn)定溫度堿提一定時間。

以上述松茸蛋白堿提取的流程為基礎，以松茸蛋白的提取率為指標，保持其他條件不變的情況下分別考察料液比(1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90)、堿提溫度(40，50，60，70，80，90 ℃)、堿提時間(0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5 h)和pH(7.5，8.5，9.5，10.5)對松茸蛋白提取率的影響。

1.4 超聲輔助提取松茸蛋白

基于1.3中得到的最佳堿提條件，研究超聲輔助提取時間對松茸蛋白提取率的影響。以松茸蛋白的提取率為指標，料液比為1∶50，在常溫下進行超聲后繼續(xù)進行堿提，堿提條件參照1.3中得到的最佳蛋白提取條件，考察最佳超聲時間(5，10，20，30，40 min)對松茸蛋白提取率的影響。

根據(jù)單因素試驗優(yōu)化的結果，考察在超聲輔助的前提下堿提法中各單因素的變化對蛋白提取率的影響。由于料液比對松茸蛋白提取的影響很小，則固定料液比為1∶50，只選取影響顯著的3個因素：溫度(X1)、時間(X2)、pH(X3)。以松茸蛋白提取率為響應值，采用Box-Behnken設計與響應面分析軟件設計三因素三水平響應面優(yōu)化，對提取條件進行分析與優(yōu)化，試驗因素及水平見表1。

表1 響應面試驗因素及水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.5 固體硫酸法沉淀松茸蛋白

1.5.1 鹽析法沉淀蛋白

向松茸蛋白提取液中加入不同質(zhì)量的固體硫酸銨，緩慢攪拌使其溶解，在室溫下勻速混合1 h，在4 ℃下靜置過夜，將有沉淀析出的溶液輕搖混勻后，以10000 r/min離心20 min。用PBS緩沖液溶解沉淀得松茸蛋白溶液，測定溶液中蛋白含量，確定沉淀松茸蛋白的硫酸銨溶液最佳飽和度。

1.5.2 透析除鹽

將松茸蛋白溶液置于透析袋中，4 ℃過夜，期間更換3次PBS緩沖液，進行透析除鹽。

1.5.3 冷凍干燥

將透析后的松茸蛋白溶液進行冷凍干燥，得松茸蛋白凍干粉。

1.5.4 松茸蛋白的SDS-PAGE電泳檢測

將適量松茸蛋白凍干粉用50 μL PBS (50 mmol/L， pH 7.5)緩沖液溶解，離心取15 μL樣液與15 μL 2×Buffer混合后于沸水浴中煮沸10 min，冷卻離心，每孔加20 μL上清液上樣。采用12.5%的SDS-PAGE蛋白預制膠進行恒壓(120 V)電泳，待溴酚藍至前沿1 cm左右結束電泳，使用蛋白染色液進行凝膠染色。

2 結果與分析

2.1 松茸蛋白的提取

2.1.1 單因素對堿提法提取松茸蛋白的影響

2.1.1.1 料液比對松茸蛋白提取率的影響

由圖1可知，在相同反應條件下，松茸蛋白的提取率隨著固液比的逐漸增大而逐漸上升，但從1∶50開始松茸蛋白提取率的上升趨勢逐漸變緩，提取率上升并不明顯。這可能是由于在1∶50之前松茸干粉在溶液中的溶解還不完全，而隨著料液比的逐漸增加，料液間的相互接觸面積逐漸增加而使提取率上升，考慮到試驗的經(jīng)濟實惠性，后續(xù)的試驗采用固定1∶50的料液比進行。

圖1 料液比對松茸蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of Tricholoma matsutake protein

2.1.1.2 pH對松茸蛋白提取率的影響

由圖2可知，溶液的pH由6升高到7時，提取率迅速提高。高于7以后，提取率上升趨勢變緩。當達到9.5時，提取率達到最大值，高于此pH，提取率下降。出現(xiàn)這種趨勢的原因是溶液中合適的堿環(huán)境能夠破壞松茸細胞壁，使松茸蛋白大量釋放，進而呈現(xiàn)提取率不斷上升的趨勢，而過高的堿濃度會使美拉德反應的進行加快，使提取率下降，故本試驗選取pH 9.5為松茸蛋白堿提法提取的最佳pH。

圖2 pH對松茸蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.1.3 時間對松茸蛋白提取率的影響

由圖3可知，當提取時間由1 h提高到2.5 h時，提取率迅速升高，到2.5 h時達到最高值，此后提取率呈現(xiàn)下降趨勢。出現(xiàn)這種情況的原因是在2.5 h前松茸細胞壁在堿液的作用下還未被完全破壞，使其內(nèi)在的活性成分沒有得到完全釋放，而2.5 h后堿液破壞松茸蛋白釋放的蛋白，導致蛋白提取率下降，故選擇2.5 h為松茸蛋白堿提法提取的最佳時間。

圖3 時間對松茸蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.1.4 溫度對松茸蛋白提取率的影響

由圖4可知，當溶液溫度為75 ℃時，提取率最高，達到峰值。溫度由50 ℃提高到75 ℃時，提取率迅速上升，當大于75 ℃后，隨著溫度升高，提取率迅速下降。出現(xiàn)這種情況的原因是逐漸升高的溫度會導致細胞壁逐漸被破壞，使蛋白質(zhì)加速釋放，而當溫度過高時溶液中析出的蛋白質(zhì)發(fā)生變性從而導致提取率下降，故選擇75 ℃為松茸蛋白堿提法提取的最佳溫度。

圖4 溫度對松茸蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

綜上，對松茸蛋白的堿提條件進行了單因素研究，確定了最佳條件：料液比為1∶50，pH為9.5，提取時間為2.5 h，溫度為75 ℃，此時松茸蛋白提取率為4.9%。

2.1.2 超聲輔助對堿提法提取松茸蛋白的影響

對松茸干粉溶液進行超聲輔助堿提，研究超聲時間對蛋白提取率的影響。由圖5可知，超聲時間為20 min時蛋白提取率最高，為5.6%，比單獨使用堿提法提高了14%。

圖5 超聲時間對松茸蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate ofTricholoma matsutake protein

2.1.3 超聲輔助堿提法提取松茸蛋白的響應面優(yōu)化

2.1.3.1 響應面優(yōu)化結果與分析

超聲輔助堿提法提取松茸蛋白的響應面設計及結果見表2。

表2 Box-Behnken松茸蛋白質(zhì)提取優(yōu)化試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken optimization test design and results of Tricholoma matsutake protein extraction

續(xù) 表

在超聲輔助提取20 min的基礎上，采用Design Expert 8.0.6.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進行擬合分析，擬合二次方程為Y=8.02-0.31A-0.29B-0.25C+0.35AB-0.23AC+0.12BC-1.06A2-0.96B2-0.035C2。

2.1.3.2 二次回歸模型的建立及顯著性分析

由表3可知，模型的F=87.56，P=0.0001<0.05，說明該模型差異較顯著；失擬項的P=0.1197>0.05,表明回歸模型在可接受范圍內(nèi)。模型決定因素R2=0.9912，校正系數(shù)RAdj2=0.9799，說明松茸蛋白提取率與該模型擬合程度較高，能很好地反映各因素和響應值之間的關系。模型中A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2均小于0.05，說明A、B、C 3個因素及3個因素的交互項對松茸蛋白提取率均具有顯著影響；C2值為0.5769>0.05，說明該項對松茸蛋白提取率無顯著影響。綜上所述，各因素對松茸蛋白提取率影響的主次順序為時間>溫度>pH。

表3 回歸模型各項方差分析Table 3 Variance analysis of each item of regression model

2.1.3.3 響應面各因素交互作用分析及驗證試驗

3D曲面圖平緩和陡峭的趨勢可以直觀、完整地反映出各因素對松茸蛋白提取率的影響。表面越陡，此因素對結果的影響越大，表面越光滑，則該因素對結果的影響越小。等高線圖提供了兩個獨立變量之間相互作用的更直觀視圖。等高線圖形狀越接近橢圓，則相關性越大，而越接近法線圓，則相關性越小。

由圖6～圖8可知，在pH固定的前提下，松茸蛋白的提取率隨著時間和溫度的變化其變化幅度較大；而在溫度和時間固定的前提下，松茸蛋白的提取率隨著pH的變化其變化幅度較小。這也充分說明提取溫度和時間對松茸蛋白提取率的影響較顯著，對三維曲面圖的分析與方差分析的結果較為一致。通過等高線圖比較，溫度與時間的相互作用不大，而時間與pH和溫度與pH之間的相互作用較大。

綜合分析以上結果并結合回歸模型，確定松茸蛋白質(zhì)的最佳提取工藝參數(shù)為時間1.46 h，溫度74.00 ℃，pH 9.06，預測理論提取率為8.39%。根據(jù)實際情況，將提取時間調(diào)整為1.5 h，溫度為74 ℃，pH值為9.0，進行驗證，結果顯示：蛋白提取率為8.30%±0.21%，與模型預測理論值基本一致，說明該模型可以模擬和預測松茸蛋白質(zhì)提取率的變化。經(jīng)過響應面法優(yōu)化條件后，提取率比優(yōu)化前提高了48%，比堿提法提高了69%。

2.2 不同飽和度的硫酸銨對松茸蛋白提取的影響

將松茸粗蛋白溶液進行硫酸銨鹽析，結果見圖9，蛋白質(zhì)含量可以直觀地反映在OD值上。上清液OD值隨著飽和度的增加下降明顯，達到90%時幾乎檢測不到蛋白。沉淀溶解后的OD值則恰好出現(xiàn)相反的趨勢，當飽和度達到90%時，沉淀OD值達到最大，說明此條件下，蛋白質(zhì)沉淀最完全。因此，確定硫酸銨飽和度為90%。

圖9 硫酸銨飽和度對松茸蛋白提取率的影響Fig.9 Effect of ammonium sulfate saturation on the extraction rate of Tricholoma matsutake protein

2.3 SDS-PAGE檢測結果

將松茸蛋白進行SDS-PAGE電泳,圖10可知，松茸蛋白的亞基分布范圍廣泛。根據(jù)電泳結果，推算得出標準蛋白分子量(Mr) 與其相對遷移率(Rf) 之間的關系公式，即lgMr=-1.2861Rf+2.1461(R2=0.9926)。從而計算出松茸蛋白分子量集中在0.81～10.14 kDa區(qū)間，在14.3～0.81 kDa范圍內(nèi)條帶較深，說明此范圍蛋白質(zhì)亞基種類多。

圖10 松茸蛋白的SDS-PAGE電泳圖 Fig.10 SDS-PAGE electropherogram of Tricholoma matsutake protein

3 討論與結論

堿提法是提取植物蛋白最常用的傳統(tǒng)方法[20]，該方法在食用菌中也有少量報道[21-22]，其原理為破壞細胞壁[23]，斷裂二硫鍵[24]。蛋白質(zhì)堿提過程中，一定范圍內(nèi)的溫度、時間、pH對提取率的影響具有相似性。提高溫度有助于細胞壁裂解，從而使提取率增加。提高pH會使蛋白質(zhì)中的酸性氨基酸和中性氨基酸解離程度增加，從而溶解性增加使提取率增加。延長時間會增加蛋白質(zhì)在溶劑中溶解并釋放到胞外的機會，從而使提取率增加。但當溫度、pH值、時間超過了閾值便會導致蛋白質(zhì)變性,從而使提取率下降。這是因為蛋白質(zhì)是生物大分子，在一定溫度和pH的溶劑中過久暴露會引起變性，從而使提取率下降。綜上，溫度、pH和時間三者相互作用，只有恰到好處，方能獲得最大提取率。本試驗結果得出了與上述相一致的結論。

超聲法提取蛋白質(zhì)屬于非傳統(tǒng)的物理方法，是當今食品加工中最常用的技術之一[25]，已在食用菌中有少量報道[26]。超聲提取的原理在于在超聲頻率范圍內(nèi)在溶劑中會產(chǎn)生大的空化泡，這些空化泡的崩潰導致極端的機械剪切力，使介質(zhì)細胞壁被破壞，從而使提取率提高[27]。本研究發(fā)現(xiàn)超聲20 min時提取率最高，超過20 min后下降，這是因為超聲時間過短，難以破壞細胞壁；超聲時間過長，蛋白質(zhì)發(fā)生變性從而使提取率下降。

為進一步提高提取率，對超聲輔助堿提法進行響應面優(yōu)化，結果發(fā)現(xiàn)松茸蛋白提取率比優(yōu)化前提高了48%，比單獨堿提法提高了69%。這進一步證明響應面法是評價多因素交互作用從而優(yōu)化工藝條件的有效方法[28]。此外，還發(fā)現(xiàn)與單獨堿提法相比，最佳提取時間由2.5 h縮短到1.5 h，pH值由9.5下降到9.0。Sari等研究表明，不同來源的植物蛋白質(zhì)采用堿提法提取，得到的提取率相差較大。谷物和豆類提取率較高，微藻類提取率較低，這主要取決于細胞壁成分。參考模式擔子菌裂褶菌的細胞壁，其主要成分為不溶于堿的β-葡聚糖、幾丁質(zhì)及其他化合物[29-30]，這可能是單獨堿提法提取率較低的主要原因，而超聲輔助法可有效破壞細胞壁，從而使提取率提高。

本試驗利用超聲輔助堿提法提取松茸蛋白質(zhì)，利用響應面法優(yōu)化提取條件，最終確定了松茸蛋白質(zhì)的提取工藝，為松茸蛋白質(zhì)的開發(fā)與利用奠定了基礎。