響應(yīng)面法優(yōu)化竹筍筍頭中黃酮、甾醇和三萜類化合物的聯(lián)合提取

譚志梅，王晨戍，王淑培，張靜，杭方學(xué)*，張煒盛

(1.廣西大學(xué) 輕工與食品工程學(xué)院，南寧 530004；2.南寧師范大學(xué) 環(huán)境與生命科學(xué)學(xué)院，南寧 530001；3.武夷學(xué)院 茶與食品學(xué)院，福建 武夷山 354300)

竹筍(bamboo shoot)是禾本科亞竹科植物的嫩苗，食用部分為竹初生的芽和嫩莖[1]。我國(guó)竹林資源豐富，種植的竹筍包括毛竹筍、麻竹筍等30多種[2]。竹筍含多糖、蛋白質(zhì)、膳食纖維、多酚等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，此外，有研究表明，竹筍對(duì)高血壓、冠心病、糖尿病等疾病有一定的預(yù)防作用?，F(xiàn)今，我國(guó)雖為竹筍生產(chǎn)、加工和銷售大國(guó)，但竹筍深加工產(chǎn)品少，資源利用率低。以毛竹筍為例，可食用部分僅占30%，而廢棄的筍頭和筍殼占50%～70%[4]，這部分加工副產(chǎn)物利用率低，從而造成竹筍原料的浪費(fèi)及環(huán)境污染。近年來(lái)，為綜合利用竹筍資源，科研人員對(duì)竹筍加工廢棄資源(筍殼、筍頭、筍渣)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和綜合利用進(jìn)行了大量研究，主要有將其開發(fā)為飼料、紡織纖維、功能性食品以及提取其中的功能活性物質(zhì)，如多糖、甾醇、酚類等[5-9]。黃酮、甾醇、三萜類化合物作為竹筍廢棄物中的活性成分，具有多種生理功能，如黃酮具有抗菌、抗炎、降血脂、抗氧化等作用[10-12]；甾醇能抗炎、抗癌、延緩衰老等，被廣泛應(yīng)用于食品和保健品行業(yè)[13-14]；三萜類化合物能抗炎、抗腫瘤和毒細(xì)胞、提高免疫調(diào)節(jié)[15-16]。對(duì)于這3種活性物質(zhì)，常見的提取方法有溶劑提取法、超聲波輔助提取法、超臨界流體萃取法、微波輔助提取法等[17-18]，但聯(lián)合提取研究較少，其中，超聲輔助提取以成本低、提取時(shí)間短、提取效率高的優(yōu)點(diǎn)被廣泛研究和應(yīng)用。本研究旨在對(duì)竹筍筍頭中黃酮、甾醇和三萜類化合物進(jìn)行聯(lián)合提取并優(yōu)化其提取工藝，以期為竹筍筍頭資源的綜合開發(fā)及利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

竹筍筍頭：由福建三信食品有限公司提供。

1.2 試劑

蘆丁、混合植物甾醇、齊墩果酸：均為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品；石油醚(30～60 ℃)、氯仿、冰醋酸、高氯酸(AR)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇：三圓化學(xué)試劑有限公司；亞硝酸鈉、乙酸酐、硫酸(AR)：西隴化工股份有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉(AR)：上海展云化工有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

KQ-300E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；電子天平 奧豪斯儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；DHZ-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；V-1100D可見光分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；PW80超微粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考王俊青等[19]的方法進(jìn)行蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，用于黃酮提取得率的計(jì)算。以溶液在λ=510 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=9.2366x+0.0665，R2=0.9997；參考項(xiàng)發(fā)暉等[20]的方法繪制甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度為縱坐標(biāo)，甾醇標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性關(guān)系式為y=1.117x+0.0053，R2=0.9993；參考曾慧慧等[21]的方法繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于三萜類化合物得率的計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)線性方程為y=65.875x-0.032，R2=0.9991。

1.4.2 樣品的制備及含量的測(cè)定

將竹筍頭曬干烘干后粉碎，過(guò)60目篩備用。準(zhǔn)確稱量2.0 g樣品粉末于250 mL平底燒瓶中，加入一定體積的乙醇溶液，置于已加熱至預(yù)定溫度的超聲波清洗儀中進(jìn)行浸提。提取時(shí)間結(jié)束后趁熱抽濾，冷卻后用20 mL石油醚萃取3次，完成后分裝于50 mL刻度試管中，原溶劑定容后搖勻。乙醇相溶液取1，0.2 mL，石油醚相取20 mL于試管中，蒸干溶劑分別作為黃酮、三萜類、甾醇樣品。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法處理樣品并測(cè)定吸光度。以樣品吸光度對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中黃酮、甾醇和三萜類化合物的濃度(mg/mL)。得率計(jì)算方法：得率(mg/g)=(樣品濃度×樣液體積×稀釋倍數(shù))/樣品質(zhì)量。

1.4.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以黃酮、甾醇、三萜類化合物的提取得率為考察指標(biāo)，以乙醇濃度、料液比、超聲提取時(shí)間、提取溫度作為主要影響因素，對(duì)各個(gè)因素選取5個(gè)不同水平(乙醇濃度50%、60%、70%、80%、90%；料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30；提取時(shí)間10，20，30，40，50 min；提取溫度40，50，60，70，80 ℃)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用Design-Expert V8.0.6.1 軟件，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃酮、甾醇、三萜類化合物的提取得率為響應(yīng)因子，對(duì)乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取溫度4個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)一步尋求聯(lián)合提取的最優(yōu)條件。試驗(yàn)的因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平Table 1 The factors and levels of response surface test

1.4.5 數(shù)據(jù)處理與分析

運(yùn)用Excel 2019統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20軟件。方差分析采用ANOVA分析，采用Duncan's多重比較進(jìn)行差異顯著性分析。圖表繪制采用Origin 9.0軟件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析使用Design-Expert V8.0.6.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取得率的影響

乙醇濃度對(duì)黃酮、甾醇和三萜提取得率的影響見圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)提取得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield

由圖1可知，黃酮和三萜的得率隨著乙醇濃度的升高呈先升高而后下降的趨勢(shì)，分別在80%、70%取得最高得率，甾醇得率隨著乙醇濃度的增加而增加，在乙醇濃度達(dá)80%后上升變緩。這可能是由于黃酮、甾醇、三萜類化合物都是羥基化合物，它們會(huì)與筍頭中的一些營(yíng)養(yǎng)成分如蛋白質(zhì)、多糖等由氫鍵連接，隨著乙醇濃度的增加，氫鍵遭到破壞，使得提取物溶出率增加，當(dāng)濃度繼續(xù)增大，高濃度溶劑會(huì)使蛋白質(zhì)變性，阻礙化合物溶出[22]。溶劑的極性也會(huì)影響物質(zhì)的提取，隨著乙醇濃度的增加，溶劑極性改變，在適宜的溶劑極性條件時(shí)提取效果最佳，超過(guò)適宜濃度時(shí)，提取得率可能下降[23]。綜合3種物質(zhì)的提取得率，選擇聯(lián)合提取的乙醇濃度為80%。

2.1.2 料液比對(duì)提取得率的影響

在提取溫度70 ℃、提取時(shí)間30 min、乙醇濃度70%的條件下，考察不同料液比對(duì)提取得率的影響。由圖2可知，目標(biāo)產(chǎn)物的提取得率在料液比為1∶10～1∶30范圍內(nèi)呈先上升快后趨于平緩的變化過(guò)程。原因可能是整個(gè)提取過(guò)程是一種傳質(zhì)過(guò)程，隨著溶劑量的增加，稀釋了溶液中黃酮、甾醇和三萜的質(zhì)量濃度，使得固液相間化合物濃度差增大，增加了提取過(guò)程中的傳質(zhì)動(dòng)力[24]。此外，溶劑的增加使得濃度減小，傳質(zhì)阻力減小，利于提取。當(dāng)料液比超過(guò)適宜范圍后，其他雜質(zhì)的溶出增加，對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的溶出形成競(jìng)爭(zhēng)性抑制[25]。因此，考慮到實(shí)際提取效果以及原料的消耗，選取聯(lián)合提取的料液比為1∶25。

圖2 料液比對(duì)提取得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響

由圖3可知，黃酮、甾醇和三萜的得率在提取時(shí)間為10～30 min范圍內(nèi)隨著時(shí)間的增加而上升，超過(guò)30 min之后黃酮和甾醇的得率變化不大，而三萜的得率明顯下降。原因可能是物質(zhì)的提取需要一定時(shí)間才能充分溶出，在提取時(shí)間為30 min之前，隨著提取時(shí)間的增加，筍頭樣品與乙醇溶液接觸得更充分，目標(biāo)產(chǎn)物的溶出率增加，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增長(zhǎng)時(shí)，溶劑中目標(biāo)產(chǎn)物的濃度上升，濃度差減小，以至達(dá)到平衡便不會(huì)再溶出[26]。而三萜類化合物在提取時(shí)間達(dá)到30 min以后提取得率明顯下降，可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶液長(zhǎng)時(shí)間處于70 ℃的高溫下，破壞了已溶出的三萜類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致得率下降[27]。因此，選取提取時(shí)間為30 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield

2.1.4 提取溫度對(duì)提取得率的影響

提取溫度對(duì)提取得率的影響見圖4。

由圖4可知，黃酮得率在溫度為40～80 ℃范圍內(nèi)先上升后趨于穩(wěn)定，甾醇和三萜得率都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，甾醇下降更明顯。當(dāng)溫度升高時(shí)，分子熱運(yùn)動(dòng)增加，植物細(xì)胞壁破裂，提取得率明顯提升[28]，溫度持續(xù)升高到超過(guò)70 ℃以后，使得乙醇緩慢揮發(fā)，濃度降低，還可能導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物的分解，致使產(chǎn)物的得率有所下降[29]，因此，選擇提取溫度為70 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)軟件Design-Expert V8.0.6.1中的Box-Behnken設(shè)計(jì)，以黃酮得率、甾醇得率和三萜得率為試驗(yàn)因子進(jìn)行了27個(gè)提取試驗(yàn)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The response surface experimental design and results mg/g

對(duì)表2中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，得到黃酮得率、甾醇得率和三萜得率與各因素變量的二次方程模型，該模型的方差分析結(jié)果見表3～表5。

Y黃酮得率= 4.64-0.18A+0.37B+0.62C+0.47D-0.081AB+0.000AC+0.040AD+0.18BC+0.15BD+ 0.12CD-0.26A2-0.28B2-0.58C2-0.37D2。

Y甾醇得率=3.98+0.59A+0.077B+0.091C-0.20D-0.13AB-0.011AC+0.017AD+8.500E-003BC+0.14BD+5.500E-003CD-0.43A2-0.20B2-0.10C2-0.25D2。

Y三萜得率=9.20-0.15A+0.42B+0.39C+0.016D-0.028AB+0.095AC+0.000AD+0.057BC-0.057BD-0.085CD+0.026A2-0.53B2-0.61C2-0.28D2。

表3 黃酮得率的回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model of the yield of flavonoids

表4 甾醇得率的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model of the yield of sterols

表5 三萜得率的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model of the yield of triterpenoids

由表3～表5可知，建立的筍頭黃酮、甾醇、三萜提取模型的P值均<0.0001，模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，回歸模型的RAdj2分別為0.9614，0.9502，0.9061，表明建立的模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，可用于筍頭中3種化合物提取得率的預(yù)測(cè)和分析。黃酮提取試驗(yàn)中一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均為極顯著，交互項(xiàng)中BC、BD的交互作用顯著，由F值可知，4個(gè)因素的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間(C)>提取溫度(D)>料液比(B)>乙醇濃度(A)；在甾醇提取試驗(yàn)中，一次項(xiàng)A、D極顯著，B、C顯著；二次項(xiàng)A2、B2、D2極顯著，C2顯著；交互項(xiàng)AB、BD顯著，4個(gè)因素的影響順序?yàn)椋阂掖紳舛?A)>提取溫度(D)>提取時(shí)間(C)>料液比(B)；三萜提取試驗(yàn)中一次項(xiàng)A、B、C極顯著，二次項(xiàng)B2、C2、D2均為極顯著，交互項(xiàng)均不顯著，各因素的影響順序?yàn)椋毫弦罕?B)>提取時(shí)間(C)>乙醇濃度(A)>提取溫度(D)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)出的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度82.46%，料液比1∶27.24，提取時(shí)間34.74 min，提取溫度71.84 ℃，在此提取條件下黃酮、甾醇和三萜得率分別是4.97，4.07，9.29 mg/g?？紤]到實(shí)際操作情況，調(diào)整最佳工藝條件為乙醇濃度83%，料液比1∶28，提取時(shí)間35 min，提取溫度72 ℃，在此條件下經(jīng)過(guò)3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出黃酮得率是4.88 mg/g；甾醇得率是3.98 mg/g；三萜得率是9.25 mg/g。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與模型理論值相近，說(shuō)明該模型能夠較好地用于黃酮、甾醇和三萜聯(lián)合提取工藝參數(shù)的優(yōu)化。

3 結(jié)論

本研究以竹筍加工廢棄物的筍頭為試驗(yàn)原料，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)竹筍筍頭中黃酮、甾醇、三萜的聯(lián)合提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，得出最優(yōu)的聯(lián)合提取工藝參數(shù)為乙醇濃度83%，料液比1∶28，提取時(shí)間35 min，提取溫度72 ℃。在此條件下黃酮得率是4.88 mg/g，甾醇得率是3.98 mg/g，三萜得率是9.25 mg/g。與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差分別為0.026%、0.022%、0.004%，表明試驗(yàn)建立的回歸模型能有效預(yù)測(cè)3種活性物質(zhì)的提取率。該試驗(yàn)工藝為開發(fā)竹筍加工副產(chǎn)物，從而提高竹筍產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益提供了一定的理論依據(jù)。