香煙煙霧誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病模型小鼠氣道上皮屏障損傷的機(jī)制*

江宇航 ， 梅曉峰 ， 賈利丹 ， 田燕歌 ，2， 趙 鵬 ，2△

（1河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南省中醫(yī)藥防治呼吸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046；2河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450046）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種常見慢性疾病，主要表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、咳痰等持續(xù)性的呼吸道癥狀以及不可逆的氣流受限，通常與多種因素引起的炎癥反應(yīng)引發(fā)的氣道或肺泡異常有關(guān)［1］。我國40 歲以上人群COPD 患病率約13.7%，近1 億患者，為我國第3位致死疾病，已成為我國重大公共衛(wèi)生問題［2-3］。氣道上皮細(xì)胞間通過閉合蛋白（occludin，OCLN）、閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）等緊密連接蛋白和黏附連接蛋白構(gòu)成完整的屏障；病原微生物或有害氣體如香煙煙霧（cigarette smoke，CS）暴露可以直接誘發(fā)炎癥反應(yīng)破壞上皮屏障，如降低ZO-1、OCLN 蛋白表達(dá)等。因此，上皮屏障損傷誘發(fā)氣道病理改變是COPD 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。研究表明，COPD 患者肺組織中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）和 P38 磷酸化水平升高，上調(diào)IL-6 等炎癥因子水平，與氣道上皮細(xì)胞屏障損傷緊密相關(guān)［5］。因此，本實(shí)驗(yàn)假設(shè)CS 可以通過激活EGFR/P38 信號通路損傷COPD 模型小鼠的上皮細(xì)胞屏障，由此探討CS 在COPD 進(jìn)展中對氣道上皮屏障的影響及機(jī)制，為探索COPD 發(fā)生發(fā)展的機(jī)制與防治策略提供依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 SPF 級 BALB/c 小鼠 72 只，雄性，體重（20±2）g，6～7 周齡，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號為110011200106861568，許可證號SCXK（京）2016-0006。本研究通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會審查批準(zhǔn)（倫理審查批號：DWLL202003210）。

1.2 細(xì)胞 人氣道上皮細(xì)胞BEAS-2B 購于上海子實(shí)生物有限公司。

1.3 香煙 紅旗渠過濾嘴香煙（烤煙型，焦油量10 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量12 mg），由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

1.4 試劑 DMEM/F-12 培養(yǎng)液，胎牛血清，1×PBS緩沖液，RIPA 裂解液，BCA 蛋白定量試劑盒，10%SDS-PAGE 凝膠試劑盒，ZO-1、OCLN、p-P38、p-EGFR和GAPDH 單克隆抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG Ⅱ抗，TNF-α ELISA Kit 和 IL-6 ELISA Kit 均購自BD。

1.5 儀器 CO2培養(yǎng)箱和CJ-2F 型超凈工作臺（Thermo）；DP70 型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)（Olympus）；動物肺功能檢測系統(tǒng)（FinePointe PFT）；全波長酶標(biāo)儀（Multiskan GO）；樣品破碎系統(tǒng)（TissueLyserⅡ）；高速臺式冷凍離心機(jī)（D-37520）。

2 方法

2.1 動物模型建立與分組 將72 只SPF 級BALB/c小鼠，隨機(jī)分為對照（control）組和 CS 組，每組36 只。第1～8 周，CS 組小鼠用CS 熏吸［將小鼠放入熏煙箱，點(diǎn)燃香煙使煙霧濃度達(dá)到（30±5）%時進(jìn)行煙霧熏吸，每次40 min，每天2 次］，control 組小鼠正常飼養(yǎng)不作處理［6］。分別于第4周、第8周和第16周取材。

2.2 香煙煙霧提取物（cigarette smoke extract，CSE）制備 取注射器抽取紅旗渠香煙煙霧溶解于完全培養(yǎng)液，以全波長酶標(biāo)儀320 nm測定，并用空白培養(yǎng)基調(diào)整其吸光值為2.0～2.2 作為100% CSE 備用。加入細(xì)胞前以無菌濾器過濾。

2.3 細(xì)胞模型建立與分組 BEAS-2B 細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F-12完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱；細(xì)胞以每皿1.5×105個接種于35 mm 皿中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%左右，將完全培養(yǎng)液換為DMEM/F-12培養(yǎng)液饑餓3～6 h，分為對照組、5%CSE組、10%CSE組和15% CSE 組，分別給予相應(yīng)濃度CSE 處理6 和24 h后，RIPA裂解液收集細(xì)胞蛋白。

2.4 肺功能測定 第0、4、8、12 和16 周采用小動物全身體積描記檢測系統(tǒng)檢測小鼠潮氣量呼氣流量（tidal volume，TV）、呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）等指標(biāo)。

2.5 肺組織病理 采用10%中性甲醛固定肺組織，72 h 后進(jìn)行石蠟包埋及HE 染色。每張肺組織切片隨機(jī)截取6 個肺泡視野圖片，在圖片中央畫出“十”字，計(jì)算每個視野的肺泡數(shù)（Na）和肺泡隔膜數(shù)（Ns），測量長度（L）和面積（S），計(jì)算公式如下：肺泡平均截距（mean linear intercept，MLI）=L/Ns，平均肺泡數(shù)（mean alveolar number，MAN）=Na/S［7］。

2.6 炎癥因子水平檢測 將小鼠右肺分離后，取50 mg 肺組織破碎勻漿取上清，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠肺組織中IL-6和TNF-α表達(dá)水平。

2.7 Western blot 收集第8周小鼠肺組織勻漿及細(xì)胞裂解液上清，BCA 法測定蛋白濃度，再用Western blot法測定p-EGFR、p-P38、OCLN和ZO-1蛋白水平。

2.8 免疫熒光 將第4、8、16 周小鼠肺組織切片，脫蠟后，在0.2% Triton X-100 中透化后封閉2 h，然后用1∶1 000稀釋的抗ZO-1和OCLN 抗體4℃孵育過夜；PBS 洗滌后，用熒光Ⅱ抗避光室溫孵育1 h，用DAPI染核15 min，封片后在熒光顯微鏡下觀察。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。動物數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)；細(xì)胞數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD-t法，方差不齊者采用Dunnett's T3 法。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺功能

第 0～4 周，control 組與 CS 組小鼠 TV 和 PEF 無顯著差異；第 8～16 周，與 control 組相比，CS 組小鼠 TV和PEF均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖1。

Figure 1. The lung function（TV and PEF）of mice in each group. Mean±SEM. n=8～10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 不同時間點(diǎn)各組小鼠肺功能變化

2 肺組織病理

肺組織HE 染色顯示，control 組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，未見病理改變；造模8 周后，CS 組小鼠肺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡腔擴(kuò)張、肺泡壁斷裂融合及氣管壁增厚等病理變化。與control組比較，第8和16 周CS 組小鼠MAN 顯著降低，MLI 顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

3 肺組織IL-6和TNF-α水平

ELISA法檢測肺組織IL-6和TNF-α結(jié)果表明，與control 組比較，第 4 周 CS 組 IL-6 和 TNF-α 表達(dá)升高，第 8 和 16 周 CS 組 IL-6 和 TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

4 氣道上皮細(xì)胞ZO-1和OCLN的表達(dá)

免疫熒光法檢測結(jié)果顯示，CS 組小鼠肺組織氣道上皮細(xì)胞間連接蛋白ZO-1 和OCLN 表達(dá)在第4、8周逐漸降低，并持續(xù)至16 周，見圖4。Western blot 結(jié)果顯示，與 control 組比較，第 8 周 CS 組中 ZO-1 和OCLN 的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖5A。此外，CSE 可顯著降低人支氣管上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和OCLN的表達(dá)（P＜0.01），見圖5B。

5 香煙煙霧誘導(dǎo)EGFR/P38信號活化作用

如圖 6 所示，CS 暴露 8 周后，與 control 組小鼠比較，CS 組小鼠肺組織中EGFR 和P38 的磷酸化水平顯著升高（P＜0.01）；CSE 誘導(dǎo)BEAS-2B 細(xì)胞 6 h 后，可見EGFR 和P38 的磷酸化水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。

討 論

近年來COPD 的患病率和病死率不斷上升，吸煙、感染以及污染都是誘發(fā)其發(fā)病的主要因素，90%的臨床患者是吸煙者或具有吸煙史［8-9］。香煙煙霧可以直接損傷氣道上皮組織，募集炎癥細(xì)胞誘發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)與組織損傷，破壞氣道上皮屏障功能［10］。本研究旨在探討在COPD 模型小鼠中CS對氣道上皮屏障作用及潛在機(jī)制。

持續(xù)性氣流受限為COPD 主要的臨床癥狀，所以肺功能的改變可作為模型制備的重要評價標(biāo)準(zhǔn)。TV 可以反映肺容積的變化，PEF 可以反映氣道整體傳導(dǎo)性變化，再結(jié)合肺組織病理變化可以判斷COPD模型是否成功。本研究采用香煙煙霧熏吸誘導(dǎo)COPD 模型小鼠。香煙煙霧暴露8 周后，CS 組小鼠TV 和PEF 顯著下降，肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡與小氣道的損傷明顯，肺組織中IL-6 和TNF-α 表達(dá)升高，并持續(xù)到16 周。這些結(jié)果表明香煙煙霧熏吸8 周可成功建立COPD 模型小鼠，且該模型病變穩(wěn)定，適宜于后續(xù)病理機(jī)制研究。

Figure 2. Pathological changes of mouse lung tissues at each time point. A：histopathological changes of lung tissues of each group（HE staining，scale bar=50 μm）；B：mean alveolar number（MAN）and mean linear intercept（MLI）were detected.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖2 不同時間點(diǎn)小鼠肺組織病理

Figure 3. The expression levels of inflammatory cytokines（IL-6 and TNF-α）in lung tissues. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 小鼠肺組織炎癥因子表達(dá)變化

Figure 4. The protein levels of ZO-1（A）and OCLN（B）in lung of mice（scale bar=50 μm）.圖4 小鼠肺組織ZO-1和OCLN蛋白表達(dá)

氣道上皮屏障結(jié)構(gòu)能夠抵御空氣過敏原、污染物和病原體等有害物質(zhì)入侵，且可以及時啟動免疫應(yīng)答清除有害物質(zhì)［11］。氣道上皮屏障細(xì)胞間連接方式包括緊密連接（tight junctions，TJs）和黏附連接（adherens junctions，AJs）。TJs 位于細(xì)胞頂端，限制上皮細(xì)胞的通透性［12］，由跨膜蛋白、OCLN 和 ZO-1 等組成。有學(xué)者觀察到COPD 患者支氣管上皮中TJs相關(guān)蛋白ZO-1 和OCLN 表達(dá)降低，上皮屏障功能減弱，而糖皮質(zhì)激素可上調(diào)上皮屏障功能基因表達(dá)［13-16］；香煙煙霧可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞TJs 相關(guān)蛋白水平表達(dá)下調(diào)，破壞緊密連接的完整性［5］，而布地奈德可上調(diào) ZO-1 表達(dá)［17］。本研究采用 CS 給予小鼠暴露后，第4、8、16 周小鼠肺組織氣道上皮細(xì)胞間連接的相關(guān)蛋白ZO-1 和OCLN 表達(dá)逐漸降低，證明在小鼠COPD 發(fā)展過程中香煙煙霧可以破壞肺組織氣道上皮細(xì)胞間的TJs 造成氣道屏障損傷。此外，CSE 可以濃度依賴性誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞連接蛋白ZO-1 和OCLN 表達(dá)降低。由此表明，CS 可以破壞上皮細(xì)胞間連接損傷氣道上皮細(xì)胞屏障。

EGFR 表達(dá)于肺支氣管和肺泡上皮細(xì)胞，調(diào)控細(xì)胞增殖、創(chuàng)傷修復(fù)等生理過程［18-19］。CS可以激活EGFR 從而上調(diào) IL-6 表達(dá)破壞上皮屏障完整性［20-21］。臨床研究顯示，COPD 患者肺組織中p-EGFR 表達(dá)顯著上升［22］。此外，P38作為MAPK信號通路分子之一，可以將細(xì)胞將信號由細(xì)胞表面?zhèn)髦良?xì)胞核內(nèi)，上調(diào)炎癥因子如IL-6和IL-1等表達(dá)［23］。有研究證明，P38磷酸化水平升高可導(dǎo)致上皮細(xì)胞正常功能受損［24］。本研究顯示CS暴露8周建立COPD模型小鼠，且肺組織中EGFR 和P38 的磷酸化水平顯著升高。體外研究顯示，CSE 誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞 6 h 后，EGFR 和 P38 磷酸化水平顯著升高。以上結(jié)果表明，EGFR/P38 信號通路活化參與了CS誘導(dǎo)小鼠氣道上皮屏障損傷。

Figure 5. Expression levels of tight junction proteins in the lung tissues（A）and airway epithelial cells（B）induced by CS and CSE，respectively. The protein levels of ZO-1 and OCLN were detected by Western blot. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖5 香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠肺組織和氣道上皮細(xì)胞的細(xì)胞間連接蛋白表達(dá)

Figure 6. Expression levels of EGFR/P38 signaling proteins in the lung tissues（A）and airway epithelial cells（B）induced by CS and CSE，respectively. The protein levels of p-EGFR and p-P38 were detected by Western blot. Mean±SEM. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖6 香煙煙霧誘導(dǎo)小鼠肺組織和氣道上皮細(xì)胞的EGFR/p38信號蛋白表達(dá)

綜上所述，CS 誘導(dǎo)小鼠COPD 疾病發(fā)生發(fā)展與氣道屏障損傷有關(guān)；其中CS 可以直接誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞連接損傷，且與EGFR/P38 信號活化有關(guān)。因此，阻抑EGFR/P38 信號活化、保護(hù)氣道上皮屏障可能是改善COPD的有效途徑。