足三里和腎腧穴位埋線對(duì)大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎NF-κB信號(hào)通路的影響*

陳麗川， 段 波， 喻 昭， 馬志毅， 孟倩文

（武漢市中醫(yī)醫(yī)院風(fēng)濕病科針灸科，湖北 武漢 430050）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種由遺傳因素以及環(huán)境因素引起的疾病，其特征在于關(guān)節(jié)、軟骨和骨骼的滑膜組織及較少見的關(guān)節(jié)外部位的炎癥變化［1］。炎癥進(jìn)一步引起關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和隨后的軟骨及骨骼破壞，因此RA 最終導(dǎo)致功能缺損、殘疾和死亡率增加［1-2］。目前藥物治療仍是治療RA 的主要方法，早期的藥物通常采用非甾體抗炎藥和糖皮質(zhì)激素等，但這些藥物并不能起到治愈性或預(yù)防性的作用［3］。對(duì)于RA 進(jìn)展到后期的病人而言，手術(shù)介入有治療效果，但也有相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)［4］。

穴位埋線（acupoint catgut embedding，ACE）是古代傳統(tǒng)針灸與現(xiàn)代療法相結(jié)合的延伸和發(fā)展。它通過(guò)在穴位內(nèi)嵌入的可吸收羊腸線產(chǎn)生持久的刺激，再加上其易于操作和長(zhǎng)期作用的特性，常被用于治療RA［5-6］。研究表明，足三里和腎腧穴埋線能減輕RA 的炎癥反應(yīng)，同時(shí)可下調(diào)滑膜細(xì)胞MMP-2 和MMP-9 的表達(dá)［7-8］。目前關(guān)于 ACE 治療 RA 的作用機(jī)制研究較少，因此本研究采用ACE 聯(lián)合藥物干預(yù)大鼠RA 并探討其中核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路的改變。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性 SD 大鼠 30 只，8 周齡，體重為150～180 g，來(lái)源于三峽大學(xué)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（鄂）2018-0104；于溫度22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%的飼養(yǎng)條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，人工光照明暗各12 h。在本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等相關(guān)文件標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)與處置。

1.2 試劑 戊巴比妥鈉和完全弗氏佐劑（Sigma）；來(lái)氟米特（leflunomide，LEF）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蘇木素和伊紅（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；中性樹脂（國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司）；大鼠白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-8酶聯(lián)免疫吸附試劑盒、GAPDH 抗體、羊抗兔蛋白Ⅱ抗及NF-κB p65抗體（Bioswamp）；蛋白質(zhì)Marker（Helix）；化學(xué)發(fā)光試劑（Millipore）；p-p65抗體（Cell Signaling Technology）；MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.3 儀器 正置顯微鏡和石蠟切片機(jī)（Leica）；生物組織包埋機(jī)（孝感闊海醫(yī)療科技有限公司）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher）；電泳儀（Bio-Rad）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能科技有限公司）

2 方法

2.1 大鼠RA 模型的構(gòu)建與鑒定 大鼠右后足趾皮下注射0.1 mL完全弗氏佐劑構(gòu)建大鼠RA 模型［9］，對(duì)照組不注射完全弗氏佐劑，注射等體積PBS。免疫大鼠右后足24 h后開始出現(xiàn)明顯紅腫；在5～6 d后出現(xiàn)一個(gè)炎癥高峰，跖骨和足骨出現(xiàn)多處紅斑，足趾明顯腫脹；11～12 d 出現(xiàn)次級(jí)炎癥高峰；20 d 后免疫的大鼠右后足嚴(yán)重紅腫，大鼠行走受限，即可判定造模成功。

2.2 分組及處理 將30 只大鼠隨機(jī)分為5 組：對(duì)照組、模型組、LEF 組、ACE 組和 ACE+LEF 組，每組 6只。除對(duì)照組外，其他組均按照2.1 的方法進(jìn)行造模。各組于造模第10 天開始治療，對(duì)照組與模型組每天灌胃生理鹽水1 次，連續(xù)42 d；LEF 組每天灌胃LEF（10 mg·kg-1·d-1），連續(xù) 42 d；ACE 組采用主穴雙側(cè)“足三里”和“腎腧”埋線，參照“大鼠穴位圖譜”，分別作穴區(qū)定位。將大鼠俯臥位固定，外展拉直后肢，將已預(yù)先置入0.8 cm 長(zhǎng)無(wú)菌羊腸線的9 號(hào)針頭，刺入已常規(guī)消毒的雙側(cè)“足三里”和“腎腧”，將腸線完全置入穴內(nèi)。治療時(shí)間共42 d，埋線3 次，每14 d 一次。ACE+LEF 組每天灌胃 LEF（10 mg·kg-1·d-1），連續(xù)42 d，灌胃的同時(shí)按照ACE 組的方法進(jìn)行穴位埋線，每14 d一次，埋線3次［10］。

2.3 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分 大鼠免疫后每7 d 進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分［11］。根據(jù)大鼠踝關(guān)節(jié)、跖趾關(guān)節(jié)和趾關(guān)節(jié)紅腫程度及受影響關(guān)節(jié)數(shù)進(jìn)行評(píng)分：正常記0 分；踝或腕關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微紅斑、腫脹記1 分；后足踝關(guān)節(jié)及跗骨出現(xiàn)紅斑和腫脹記2 分；踝關(guān)節(jié)至跖骨處或掌關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和中度腫脹記3 分；踝關(guān)節(jié)至跖骨處嚴(yán)重腫脹和紅斑，且不能負(fù)重記4 分。分別對(duì)四肢進(jìn)行評(píng)分，累計(jì)總和即為關(guān)節(jié)炎指數(shù)。

2.4 血液及組織樣本采集 在第42 天，用3%的戊巴比妥鈉麻醉大鼠，收集每只小鼠的頸動(dòng)脈血和滑膜組織樣本，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 HE 染色觀察大鼠滑膜組織變化 將大鼠滑膜組織固定，切取大約300 μm 的厚度，進(jìn)行脫水浸蠟包埋操作，包埋后切片，切片厚度為3 μm，水浴后將切片貼附于載玻片上，控片，展片后及時(shí)烤片。根據(jù)步驟進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，Leica Application Suite圖象系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2.6 ELISA 檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子水平 將血液樣本置于4 ℃冰箱中靜置1 h，呈45°角放置，3 000×g離 心 5 min 收 集 血 清 。 根 據(jù) Bioswamp 的ELISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行各組樣品中炎癥因子IL-6和IL-8含量的檢測(cè)。

2.7 免疫組化檢測(cè)大鼠滑膜組織NF-κB p65蛋白的表達(dá) 首先固定滑膜組織，沖洗后置于包埋盒內(nèi)，脫水浸蠟包埋。將蠟塊切成厚度為約4 μm 的切片，烤片，3% H2O2孵育 10 min。加入 0.5% BSA 封閉 30 min，PBS清洗3次。加入Ⅰ抗稀釋液，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗3 次。加入Ⅱ抗稀釋液，室溫孵育30 min，PBS 清洗3 次。蘇木素復(fù)染3 min，流水沖洗后乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡觀察拍照（×200）。

2.8 Western blot 檢測(cè)大鼠滑膜組織p-p65 蛋白水平 滑膜組織剪碎后加入裂解液，使用勻漿器充分裂解。4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。將各組樣品于10%的SDS-PAGE 分離，濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜。PVDF 膜放入5%的脫脂牛奶中，室溫?fù)u床封閉2 h。分別加入Ⅰ抗（p-p65 和GADPH 抗體，1∶1 000）于4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜3次后，加入山羊抗兔Ⅱ抗（1∶10 000），室溫孵育1 h。洗膜3 次后，將膜置于暗室中，發(fā)光液混勻后加在膜的正面與膜充分接觸。最后置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中檢測(cè)，利用TANON GIS軟件讀取灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較使用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠RA模型關(guān)節(jié)炎指數(shù)

如圖1 所示，造模49 d 后，與對(duì)照組相比，模型組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，LEF 組、ACE 組和 ACE+LEF 組關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著下降（P＜0.01）；其中ACE+LEF 組治療后關(guān)節(jié)炎指數(shù)較LEF組和ACE組更低，治療效果最佳。此外，在治療過(guò)程中關(guān)節(jié)炎指數(shù)略有增加，但隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)關(guān)節(jié)炎指數(shù)呈下降趨勢(shì)。

Figure 1. Comparison of arthritis index in each group. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs model group.圖1 各組關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

2 大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果

如圖2 所示，對(duì)照組顯示出正常的關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)，沒有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠表現(xiàn)出滑膜增生，滑膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，關(guān)節(jié)軟骨侵蝕；ACE及LEF 治療的RA 大鼠滑膜細(xì)胞增生有所改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；然而，ACE+LEF 組的大鼠表現(xiàn)出輕度的滑膜增生、炎癥和軟骨侵蝕。

Figure 2. The synovial tissues of rats observed by HE staining（scale bar=50 μm）. The arrows indicate inflammatory cell infiltration and cartilage erosion.圖2 HE染色觀察大鼠滑膜組織

3 大鼠血清IL-6和IL-8含量的變化

ELISA 結(jié)果如圖3 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清IL-6 和IL-8 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，LEF 組、ACE 組和 ACE+LEF 組大鼠血清IL-6 和 IL-8 含量均顯著降低（P＜0.01），其中 ACE+LEF 組 IL-6 和 IL-8 含量最低；與 ACE 組相比，ACE+LEF組IL-6和IL-8含量顯著降低（P＜0.01）。

Figure 3. The serum levels of IL-6 and IL-8 in rats. Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜ 0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs ACE group.圖3 大鼠血清中IL-6和IL-8含量

4 大鼠滑膜組織NF-κB p65表達(dá)的變化

免疫組化結(jié)果如圖4 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠滑膜組織NF-κB p65 陽(yáng)性表達(dá)顯著增多（P＜0.01）；與模型組比較，LEF 組、ACE 組和 ACE+LEF組大鼠滑膜組織NF-κB p65 陽(yáng)性表達(dá)均顯著減少（P＜0.05），其中ACE+LEF 組的表達(dá)最少；與ACE 組相比，ACE+LEF 組 NF-κB p65 陽(yáng)性表達(dá)減少，但差異不顯著。

5 大鼠滑膜組織p-p65蛋白水平的比較

Western blot 結(jié)果如圖5 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠滑膜組織p-p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，ACE 組、LEF 組和 ACE+LEF組大鼠滑膜組織p-p65 蛋白水平均顯著降低（P＜0.01），其中 ACE+LEF 組 p-p65 水平最低；與 ACE 組相比，ACE+LEF組p-p65水平顯著降低（P＜0.01）。

討 論

RA 在全球的發(fā)病率達(dá)0.5%～1%，主要年齡段在 30～60 歲［12-13］，且越來(lái)越年輕化。治療 RA 的藥物利用率低，起效較慢，而且可引起嚴(yán)重的副作用［14］。因此，研究其發(fā)病機(jī)制并尋找有效的治療方法具有重要意義。目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)的持續(xù)作用是RA 病變加重的主要原因［15］。研究顯示，CFA 誘導(dǎo) RA 大鼠模型成功率高、重復(fù)性好，廣泛用于RA 致病機(jī)理的研究。本實(shí)驗(yàn)采用CFA 誘導(dǎo)的RA 大鼠模型造模完成后大鼠右后足出現(xiàn)嚴(yán)重紅腫，提示本研究模型建立成功。

Figure 5. Comparison of p-p65 protein levels in synovial tissues of rats. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs model group；△△P＜0.01 vs ACE group.圖5 大鼠滑膜組織p-p65蛋白水平的比較

ACE 能夠改善機(jī)體的血液循環(huán)，促進(jìn)經(jīng)絡(luò)氣血疏通，因此可以作為治療RA 的有效的方法，而且該治療方法在早年也已得到驗(yàn)證［16］。足三里有固本培元、祛風(fēng)利濕和通經(jīng)活絡(luò)之效果；而腎腧穴滋陰補(bǔ)陽(yáng)，也具備培元之功，因此本研究采用這兩個(gè)穴位進(jìn)行埋線［8］。我們的結(jié)果顯示，ACE 組大鼠相較于模型組關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著下降，提示穴位埋線能夠有效緩解關(guān)節(jié)炎的相關(guān)癥狀。LEF 是用于治療RA 的常見藥物，通常也與其他藥物聯(lián)用［17-18］。本研究采用ACE 和LEF 單獨(dú)或聯(lián)合治療，結(jié)果顯示，無(wú)論單獨(dú)或聯(lián)合使用，RA 大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低，證明ACE對(duì)治療RA具有一定的作用。

滑膜炎癥反應(yīng)是RA 的主要特征之一，本研究顯示ACE 及LEF 均能改善RA 大鼠的滑膜細(xì)胞增生并緩解炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明RA 大鼠滑膜組織中炎癥反應(yīng)得到了緩解。IL-6 和IL-8 在RA 中起到重要作用，IL-6 通過(guò)作用于分泌活性氧中間體和蛋白水解酶的中性粒細(xì)胞而引起炎癥和關(guān)節(jié)破壞；IL-8 誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子并增加糖胺聚糖的釋放，同時(shí)抑制軟骨細(xì)胞增殖并刺激血管生成繼而加重炎癥反應(yīng)［19-20］。我們檢測(cè)了RA 大鼠血清中IL-6和IL-8的含量，結(jié)果顯示，ACE 及 LEF 顯著減少炎癥因子 IL-6 和 IL-8 的產(chǎn)生，而ACE+LEF 組炎癥因子含量最低，表明ACE能夠顯著抑制炎癥因子IL-6和IL-8產(chǎn)生，抑制RA 的炎癥反應(yīng)，且聯(lián)合LEF后的抑制效果更好。

作為經(jīng)典的炎癥通路之一，NF-κB 信號(hào)通路在RA 進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，抑制NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)可以明顯緩解關(guān)節(jié)炎癥狀［21］。在本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)ACE 治療后大鼠滑膜組織中的NF-κB p65 表達(dá)降低，證實(shí)ACE 通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮抑炎作用。另外，在靜息狀態(tài)下，NF-κB p65 一般由 p50 及p65 形成異二聚體并結(jié)合NF-κB 抑制蛋白形成無(wú)活性的蛋白復(fù)合物，一旦接受外源刺激，NF-κB p65 最終發(fā)生磷酸化入核發(fā)揮作用［22］。由于經(jīng)典NF-κB 信號(hào)通路主要通過(guò)p65 磷酸化發(fā)揮作用，因此我們采用Western blot 檢測(cè)NF-κB p65 磷酸化水平。結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)ACE 治療后NF-κB p65 磷酸化水平顯著下降，證明ACE 能有效抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活。ACE聯(lián)合LEF治療后NF-κB p65磷酸化水平最低，因此進(jìn)一步證實(shí)穴位埋線聯(lián)合來(lái)氟米特具備抑制RA炎癥反應(yīng)的作用。

綜上所述，ACE 可通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路進(jìn)而緩解骨關(guān)節(jié)炎引起的炎癥反應(yīng)。