櫻桃李多酚類物質(zhì)成分鑒定及其改善脂代謝的作用研究*

張姣姣， 蘇黑艷·帕爾哈提， 吐克孜·吾守爾， 黃偉偉， 楊 坡， 李艷紅△， 何恩鵬△

（1新疆特殊環(huán)境物種多樣性應用與調(diào)控實驗室，新疆特殊環(huán)境物種保護與調(diào)控生物學實驗室，新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054；2新疆師范大學運動人體科學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

肥胖已成為導致其它慢性疾病甚至死亡的重要原因之一［1］，是影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題，其特點是長期攝入的能量超過了身體的能量消耗，體重和脂肪組織含量增加，致使身體出現(xiàn)慢性炎癥、肝損傷等問題，進而引起一系列慢性疾病發(fā)生［2-3］。

流行病學研究表明，多攝入新鮮水果有助于減肥［4-5］。其中，深色、富含多酚的水果（如藍莓、覆盆子和楊梅）提取物具有顯著改善糖脂代謝的作用。例如，在高脂飲食（high-fat diet，HFD）誘導的糖尿病小鼠中，藍莓提取物可顯著降低血清和肝臟甘油三酯（triglyceride，TG）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平，并對肝臟起到保護作用［6］。楊梅可通過增加脂肪酸的氧化和下調(diào)脂肪酸合成相關基因的表達改善脂代謝，顯著改善肥胖相關特征，主要與其富含的多酚類物質(zhì)相關［7］。

櫻桃李（Prunus cerasiferaEhr.）屬于薔薇科李屬，主要分布于新疆伊犁霍城縣。研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃李果實富含有機酸、維生素、礦物質(zhì)、多酚等物質(zhì)，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用［8-9］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，紫果櫻桃李果汁對HFD 誘發(fā)的肥胖小鼠有預防作用且果汁中總多酚含量豐富［10］。櫻桃李果實中多酚類物質(zhì)的成分及其改善脂代謝的作用尚不明確。因此，本研究通過液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography with mass spectrometry，LC-MS）對紫果櫻桃李提取物中的多酚類化合物進行定性分析，并以HFD 喂養(yǎng)的肥胖小鼠為模型，評估其在體內(nèi)對脂代謝的改善作用及可能機制，為櫻桃李多酚降脂功能成分的開發(fā)提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

SPF 級 5～6 周齡 C57BL/6 雄性小鼠，購自南京君科生物公司，動物合格證號SCXK（蘇）2016-0010。紫果櫻桃李購自新疆伊犁霍城縣大西溝。

2 主要試劑

Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；蛋白檢測所用的Ⅰ抗、Ⅱ抗均購自上海碧云天生物技術有限公司；TEMED 和PVDF 膜購自Sigma；其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

3 主要方法

3.1 櫻桃李多酚的提取 新鮮櫻桃李采用甲醇/水/甲酸（體積比90∶9∶1）提取液浸提后，AB-8 大孔吸附樹脂吸附，60%乙醇洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空冷凍干燥成粉末。

3.2 電噴霧電離 噴霧電壓：-2.8 kV；鞘氣：40 arb；輔助氣：10 arb；氣簾氣：35；離子源溫度：350 ℃；毛細管溫度：300 ℃；-70 V；聚焦電壓：-350 V，DP2：-10 V。整個過程采用氮氣。樣品分析采用DDA 模式：Q-Orbitrap 采集范圍為 m/z 100～1 500，碎片離子掃描范圍設為m/z 50～1 500；碰撞氣：10%、30%和50%；MS 分辨率為70，000 FWHM（m/z 200）；MS2 分辨率為17，000 FWHM（m/z 200）；數(shù)據(jù)采集及分析采用Xcalibur 4.0軟件（Thermo Fisher Scientific）。

3.3 實驗動物分組及給藥 50 只小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為2組：正常對照（normal control，NC）組10 只（正常飼料喂養(yǎng)），其余40 只為高脂組（HFD喂養(yǎng)）。8 周后，將造模成功的小鼠隨機均分為4 組：HFD 組、低劑量（200 mg/kg）多酚組（HFD+L 組）、高劑量（500 mg/kg）多酚組（HFD+H 組）和奧利司他（orlistat；15.6 mg/kg）組（HFD+O 組）。灌胃給藥，每天一次。實驗進行8 周，每周稱重一次。最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h，摘眼球采血，隨即頸椎脫白處死，取腎臟、肝臟、心臟和脾臟稱重，后置于-80℃冰箱凍存。臟器指數(shù)（%）=m1/m×100%，其中m1為臟器質(zhì)量（g），m為小鼠處死前的體質(zhì)量（g）。

3.4 血清指標的測定 按照試劑盒說明書測定血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量，以及AST和ALT活性。

3.5 肝臟組織形態(tài)學分析 將肝臟用10%甲醛固定24 h以上，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，預冷，切成5 μm厚，進行HE和油紅O染色。

3.6 熒光定量PCR 檢測 Trizol 法從肝臟中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)基因序列設計特異性引物，序列見表1。按照熒光定量PCR 試劑盒操作，檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、CD36、膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白1c（sterol-regulatory element-binding protein-1c，SREBP-1c）、CCAAT/增強子結合蛋白α（CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶 1（carnitine palmitoyltransferase-1，CPT-1）和?；o酶A氧化酶（acyl-CoA oxidase，ACO）的mRNA表達，以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

3.7 Western blot 分析 肝臟樣品加入蛋白裂解液研磨后裂解，離心獲得含蛋白質(zhì)上清液。BCA 法定量蛋白濃度，SDS-PAGE 后轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉，分別加入FAS、SREBP-1c、C/EBPα、CD36、AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）、p-AMPK、ACO 和β-actin 抗體孵育，后加入山羊抗小鼠IgG 孵育。采用ECL 化學發(fā)光試劑盒顯色，蛋白凝膠成像儀觀察蛋白條帶，ImageJ 軟件對蛋白條帶進行灰度分析，計算蛋白的相對表達量。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 8.0 和SPSS 23.0軟件進行分析，結果以平均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 果實多酚主要成分質(zhì)譜分析

采用LC-MS 測定櫻桃李總多酚提取物中的多酚成分，發(fā)現(xiàn)5種酚酸和單寧，以及13種黃酮及其衍生物，主要酚類物質(zhì)為槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-阿拉伯糖苷、槲皮素、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、山柰酚-7-O-葡萄糖苷、山柰酚-7-O-蕓香糖苷、表兒茶素、3-O-咖啡酰基奎寧酸、5-O-咖啡酰基奎寧酸和4-O-咖啡?；鼘幩幔姳?。

表2 櫻桃李果實多酚主要成分質(zhì)譜分析Table 2. Analysis of main components of fruit polyphenol by mass spectrometry

2 體重和組織指數(shù)

對小鼠體重變化進行分析發(fā)現(xiàn)，干預8 周后，與HFD 組相比，HFD+H 組小鼠體重減輕，見表3。這說明櫻桃李多酚可降低因HFD引起的體重增加。

表3 不同干預方法對肥胖小鼠體重的影響Table 3. Effects of different intervention methods on body weight of obese mice（g. Mean±SD. n=10）

對小鼠脾臟、肝臟和腎臟指數(shù)進行檢測發(fā)現(xiàn)，與HFD組比較，HFD+L和HFD+H組脾臟和腎臟指數(shù)均無顯著差異（P＞0.05），而肝臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），見表4。這說明櫻桃李多酚對小鼠臟器無毒副作用，能夠減輕HFD引起的小鼠肝臟腫大。

表4 不同干預方法對肥胖小鼠組織指數(shù)的影響Table 4. Effects of different intervention methods on tissue indexes in obese mice（%. Mean±SD. n=10）

3 血清生化指標的測定

測定小鼠血清 TG、TC、LDL-C、HDL-C、AST 和ALT水平。結果顯示，櫻桃李多酚干預后，HFD+H組TG、TC、LDL-C、AST 和 ALT 水平均顯著低于 HFD 組（P＜0.05），HDL-C 水平顯著升高（P＜0.05），見圖1。這表明櫻桃李多酚能顯著降低肥胖小鼠血脂水平，減輕HFD所致肥胖對小鼠肝臟的損害。

4 肝臟組織形態(tài)學分析

采用HE和油紅O染色對小鼠肝臟進行組織學觀察，結果如圖2 所示。HE 染色結果顯示，NC 組肝小葉結構正常，細胞排列緊密，且胞漿內(nèi)未見脂滴；HFD組肝細胞體積增大，且胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂肪空泡；HFD+L和HFD+H 組胞漿內(nèi)脂肪空泡明顯減少，肝細胞排列緊密，且肝小葉結構得到改善。油紅O染色結果顯示，NC 組肝臟細胞排列緊密，細胞核為藍色，肝細胞內(nèi)有少量紅色脂滴；HFD 組細胞核數(shù)量減少，視野中出現(xiàn)大量紅色脂滴；HFD+L和HFD+H 組紅色脂滴明顯減少，脂質(zhì)積累逐漸減輕。上述結果表明，櫻桃李多酚能夠減輕肥胖造成的小鼠肝臟脂質(zhì)積累。

Figure 1. Determination of serum biochemical indexes in mice. Mean±SD. n=10.*P＜0.05 vs HFD group；#P＜0.05 vs NC group；▲P＜0.05 vs HFD+O group.圖1 小鼠血清生化指標測定

Figure 2. HE and oil red O staining of liver tissues（×200）.圖2 肝臟橫切面HE和油紅O染色

5 mRNA表達分析

熒光定量PCR 結果顯示，與HFD 組相比，HFD+L 和 HFD+H 組 脂 肪合 成 相關 因 子 PPARγ、FAS、ACC、SREBP-1c、CD36 和 C/EBPα 的mRNA 表達均顯著下調(diào)（P＜0.05），脂肪氧化相關因子CPT-1 和ACO的mRNA 表達顯著上調(diào)（P＜0.05），見圖3。這說明櫻桃李多酚能調(diào)控脂代謝相關因子的mRNA表達。

6 蛋白表達分析

Western blot 結果顯示，與 HFD 組相比，櫻桃李多酚能降低 FAS、SREBP-1c、C/EBP-α 和 CD36 蛋白表達（P＜0.05），提高 p-AMPK 與 AMPK 比值（P＜0.05），見圖4。這說明櫻桃李多酚可激活AMPK，調(diào)節(jié)脂代謝相關蛋白表達。

Figure 3. The mRNA expression of lipid metabolism-related molecules in liver tissues. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs HFD group；#P＜0.05 vs NC group；▲P＜0.05 vs HFD+O group.圖3 肝臟脂代謝相關因子的mRNA表達

討 論

多酚是一種強抗氧化劑，具有預防和治療肥胖的生物活性［11-12］。已有研究發(fā)現(xiàn)，不同顏色和品種的櫻桃李多酚的抗氧化活性與總多酚含量有關，其中紫色果實的總多酚含量最高［13］。本課題組前期對紫果櫻桃李總多酚中黃酮類、酚酸類和黃烷醇類的含量進行測定，發(fā)現(xiàn)黃酮類是櫻桃李中的主要酚類［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃李多酚提取物中的主要成分有18種，其中5 種為酚酸和單寧，13 種為黃酮及黃酮衍生物，與前期測定結果一致。本研究為櫻桃李多酚成分功能的進一步深入研究奠定基礎。

人體內(nèi)TC、TG 和LDL-C 含量增加，會導致體內(nèi)脂肪堆積，引起動脈粥樣硬化等心血管疾?。?5-16］。本研究中，采用每天灌胃500 mg/kg 和200 mg/kg 的櫻桃李多酚，8 周后可以減少小鼠體重增加，顯著降低肥胖小鼠血清 TC、TG 和 LDL-C 含量，增加 HDL-C 含量。此外，肝臟脂滴的數(shù)量和大小也顯著降低，說明櫻桃李多酚提取物具有減肥作用。

能量代謝的信號分子AMPK 在脂代謝中發(fā)揮重要作用，可通過多條通路調(diào)控脂質(zhì)合成和分解，被認為是改善脂代謝最值得關注的靶點。AMPK 廣泛存在于真核細胞中［17］，當 AMPK 被激活磷酸化時，會下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、C/EBPα、SREBP-1c 和其他脂肪生成因子，從而減少脂肪酸、甘油三酯和膽固醇等脂質(zhì)的合成［18-21］。本研究發(fā)現(xiàn)，櫻桃李多酚能提高肥胖小鼠肝臟p-AMPK 與AMPK 蛋白的比值，降低C/EBPα、SREBP-1c、CD36 和 FAS 的 mRNA 及蛋白表達，說明櫻桃李多酚能夠激活AMPK 信號通路，調(diào)節(jié)下游轉(zhuǎn)錄因子及脂代謝相關酶的表達。

Figure 4. Expression of AMPK（A）and lipid metabolism-related proteins（B）in liver tissues. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs HFD group；#P＜0.05 vs NC group；▲P＜0.05 vs HFD+O group.圖4 肝臟AMPK及脂代謝相關蛋白表達

綜上所述，通過對櫻桃李多酚進行定性分析，我們發(fā)現(xiàn)櫻桃李中酚類物質(zhì)成分豐富。櫻桃李多酚可通過激活AMPK 信號通路調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子而改善脂代謝。本研究為櫻桃李多酚作為降脂功能成分的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。櫻桃李中多酚成分的降脂功能及作用機制仍需要進一步深入研究。