五味子甲素對腹瀉型腸易激綜合征大鼠腸上皮黏膜屏障功能的保護作用*

耿 峰， 毛 穎， 叢 珊， 杜 娟， 于春雪

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

腹瀉型腸易激綜合征（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，IBS-D）是一種以腹瀉為特征的IBS。目前，IBS-D 主要以對癥治療為主，但存在療程長，不良反應(yīng)多，停藥后易復(fù)發(fā)等弊端［1］。因此，繼續(xù)探索新的IBS-D的治療方法十分必要。

腸屏障功能障礙和炎癥反應(yīng)是IBS 的主要病理現(xiàn)象［2-3］，尤其是IBS-D患者的腸道通透性更高［4］。既往研究發(fā)現(xiàn)，IBS患者回腸末端及升結(jié)腸的腸黏膜白細胞介素（interleukin，IL）及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎介質(zhì)表達增加［5］，以及細胞緊密連接蛋白表達和分布發(fā)生改變［6］等與腸道通透性破壞有關(guān)。另外，腸上皮黏膜屏障功能是破壞能加劇IBS的炎癥反應(yīng)，且炎癥反應(yīng)也能進一步破壞腸上皮黏膜的屏障功能［7-8］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)五味子甲素（schizandrin A，SchA）在三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的動物潰瘍性結(jié)腸炎模型中具有明顯的抗腸炎作用［9-12］，據(jù)此猜測 SchA 可能同樣對 IBS-D 具有治療作用。因此，本實驗以大鼠IBS-D 模型探討SchA 是否在IBS-D 中發(fā)揮抗炎和維護腸上皮黏膜屏障功能的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗試劑 番瀉葉（購自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：廣西），按王陽等［13］方法用沸水煎藥，最終獲得含200 g/L 番瀉葉（生藥）的水煎劑，4 ℃冷藏備用；SchA（純度＞98%；MedChemExpress）；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL）試劑盒（Roche）；異硫氰酸熒光素標記葡聚糖（fluorescein isothiocyanate-dextran，F(xiàn)ITC-dextran）購自杭州新喬生物科技有限公司；IL-6、IL-1β和TNF-α對應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自南京建成生物研究所；閉鎖小帶蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）、閉合蛋白（occludin）、CD68 和CD11b 抗體（Abcam）；核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）、含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）和caspase-1（P20）抗體（Cell Signaling Technology）；RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟、ECL 化學(xué)發(fā)光試劑、胱天蛋白酶3 裂解片段（cleaved caspase-3）抗體、GAPDH 抗體和辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG 抗體（沈陽萬類生物科技有限公司）；DyLight 488或657標記的羊抗兔IgG熒光Ⅱ抗（武漢艾美捷科技有限公司）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒和SP 免疫組化試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）。

1.2 實驗動物 30 只6～7 周齡無特定病原體級雄性SD 大鼠（體重190～210 g）購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，生產(chǎn)許可證號為SCXK（黑）2019-001，飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)環(huán)境為：恒溫22～24 ℃、濕度可控（55%～65%）和12 h/12 h 光暗循環(huán)的屏障環(huán)境，在實驗前大鼠可隨意飲用水和飼料。

2 方法

2.1 IBS-D 動物模型的建立與分組處理 適應(yīng)飼養(yǎng)3 d 后，將30 只大鼠隨機分為對照組、模型組和SchA治療組，每組均10 只。參照文獻［13-15］方法建立IBS-D大鼠模型：對大鼠進行灌胃20 mL/kg 含200 g/L 番瀉葉水煎劑（注：灌胃前將番瀉葉水煎劑加熱至25 ℃），灌胃 1 h 后，束縛大鼠 2 h，每天 2 次，持續(xù)束縛 2 周。模型組和SchA 治療組大鼠均按照上述方法構(gòu)建IBS-D 大鼠模型，其中SchA 治療組在造模后給予灌胃 40 mg/kg SchA［9-10］，每天 1 次，持續(xù) 2 周；模型組給予等體積生理鹽水；對照組不進行IBS-D 造模，僅給予等體積生理鹽水。

2.2 大鼠腸痛覺敏感性測定 給藥方案結(jié)束后，按文獻［16-17］方法用腹部撤離反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）試驗評估各組大鼠內(nèi)臟敏感性。將大鼠禁水禁食10 h以上，用異氟烷吸入麻醉后，將涂有潤滑油的彈性乳膠氣囊插入大鼠結(jié)腸，待大鼠清醒30 min 后，以5 mmHg 為增量的氣壓擴張結(jié)腸，直到出現(xiàn)背部肌肉收縮且腹部抬離地面時，記錄壓力值，作為AWR 痛覺閾值。實驗重復(fù)3 次，每次間隔10 min，取平均值進行分析。

2.3 FITC-dextran 腸道通透性檢測 AWR 實驗后，分別給各組大鼠灌胃50 mg/kg FITC-dextran。4 h后，取眼眶靜脈叢血，并分離血清。按照試劑說明，將血清用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate-buffered saline，PBS）按1∶10稀釋，每只大鼠各取100 μL血清稀釋液加入黑底96 孔板中，熒光酶標儀測熒光強度值，根據(jù)標準曲線計算血清中FITC-dextran含量。

2.4 HE 染色 麻醉大鼠，處死并分離據(jù)肛門遠端（約10 cm）腸組織，按照常規(guī)法對腸組織進行石蠟包埋，并切為6 μm 厚度的連續(xù)切片。切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇再水化后，用HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.5 免疫組織化學(xué)染色 腸組織切片再水化后，依次經(jīng)3%H2O2浸泡除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，檸檬酸緩沖液高溫修復(fù)和10%羊血清封閉非特異性位點后，分別滴加ZO-1和occuldin抗體（均1：500稀釋）并37 ℃孵育2 h，用PBS 洗滌后，按照免疫組化試劑盒方法依次孵育Biotin-羊抗兔IgG 和鏈酶親和素-POD后，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況，陽性細胞可見棕黃色顆粒，從至少3 個隨機視野采集數(shù)字圖像進行進一步分析。

2.6 TUNEL 染色 用TUNEL 染色評估大鼠腸組織上皮細胞凋亡情況。腸組織切片再水化后，用不含DNase 的蛋白酶 K 作用 10 min，PBS 洗滌，然后滴加50 μL TUNEL 檢測工作液，37 ℃避光孵育 60 min，PBS 洗滌 2 次，DAPI 復(fù)染，在熒光顯微鏡下觀察，從至少3個隨機視野采集數(shù)字圖像進行進一步分析。

2.7 免疫熒光染色 腸組織切片再水化后，用10%羊血清封閉非特異性位點后，分別滴加cleaved caspase-3、CD68 和 CD11b 抗體（均 1∶1 000 稀釋）并 4 ℃孵育過夜，用PBS 洗滌后，室溫孵育Dylight 488 或657 標記的羊抗兔IgG 熒光Ⅱ抗（均1∶1 000 稀釋），熒光顯微鏡觀察染色情況，從至少3 個隨機視野采集數(shù)字圖像進行進一步分析。

2.8 腸組織中 IL-6、IL-1β 和 TNF-α 檢測 取腸組織，用10 倍體積冷PBS 勻漿。根據(jù)ELISA 試劑盒說明書，對各組勻漿液中IL-6、IL-1β和TNF-α測定。

2.9 Western blot 用含有1 mmol/L 苯甲基磺酰氟的RIPA 裂解緩沖液提取腸組織中總蛋白，然后使用增強BCA蛋白分析試劑盒檢測蛋白濃度。每樣品取40 μg 組織蛋白通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂乳封閉 2 h 后，用Ⅰ抗［抗 ZO-1、occuldin、NLRP3、ASC 和 caspase-1 抗體（均 1∶2 000），抗 GAPDH 抗體（1∶8 000）］4 ℃孵育過夜后，TBST 洗膜，然后室溫下孵育羊抗兔IgG（1∶1 000）2 h，再次洗滌，用ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶并進行分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SchA 增高IBS-D 大鼠痛覺閾值并改善腸粘膜的形態(tài)

AWR 試驗結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組AWR 閾值顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，SchA組AWR 閾值顯著降低（P＜0.05），見圖1A。大鼠腸切片HE 染色結(jié)果顯示，對照組腸絨毛完整，絨毛上皮細胞排列整齊；模型組腸絨毛結(jié)構(gòu)破壞且長度縮短，絨毛上皮同樣遭受破壞；SchA治療組腸絨毛損傷減輕，排列趨向整齊，見圖1B。

2 SchA改善IBS-D大鼠腸屏障功能

與模型組比較，SchA 組大鼠外周血中FITC-dextran 顯著降低（P＜0.01）；同時免疫組化和 Western blot結(jié)果顯示，SchA 能顯著抑制IBS-D 大鼠腸組織中ZO-1和occludin的蛋白表達（P＜0.01），見圖2。

3 SchA降低IBS-D大鼠結(jié)腸黏膜細胞凋亡

Figure 1. SchA increased pain threshold and improved histomorphological changes of colonic mucosa in IBS-D rats. A：AWR pain threshold；B：histomorphological changes of colonic mucosa（HE staining，scale bar=50 μm）. Mean±SD. n=10.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖1 SchA增高IBS-D大鼠的疼痛閾值并改善結(jié)腸黏膜的組織學(xué)形態(tài)

Figure 2. SchA improved colonic mucosal barrier function in IBS-D rats. A：the content of FITC-dextran in peripheral blood；B：protein expression of ZO-1 and occludin in colon tissue was detected by immunohistochemistry（scale bar=50 μm）；C：protein expression of ZO-1 and occludin in colon tissue was detected by Western blot. Mean±SD. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs model group.圖2 SchA改善IBS-D大鼠結(jié)腸黏膜屏障功能

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜中TUNEL和cleaved caspase-3 陽性細胞比例均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，SchA 組結(jié)腸黏膜中 TUNEL 和cleaved caspase-3 陽性細胞比例均顯著降低（P＜0.01），見圖3。

4 SchA減輕IBS-D大鼠腸炎

Figure 3. SchA reduced the apoptosis of colonic mucosal cells in IBS-D rats. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs model group.圖3 SchA降低IBS-D大鼠結(jié)腸黏膜細胞凋亡

免疫熒光顯示，模型組結(jié)腸黏膜中大量炎癥細胞聚集（CD68 和CD11b 分別標記巨噬細胞和中性粒細胞）；而SchA 組結(jié)腸黏膜中炎癥細胞數(shù)量減少，見圖4A。ELISA結(jié)果顯示，模型組結(jié)腸組織中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平較對照組均顯著升高（P＜0.01）；而SchA 組中上述炎癥因子較模型組均顯著降低（P＜0.01），見圖4B。

5 SchA 抑制 IBS-D 大鼠結(jié)腸組織 NLRP3 炎癥小體通路

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中NLRP3、ASC 和caspase-1 的表達水平均顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，SchA 組結(jié)腸中NLRP3、ASC 和caspase-1的表達水平均顯著降低（P＜0.01），見圖5。

討 論

IBS-D 屬于腸道功能性疾病，是中醫(yī)藥治療的傳統(tǒng)優(yōu)勢領(lǐng)域［18］。因此，從中藥寶庫中開發(fā)較理想的治療IBS-D 的藥物將有著十分廣闊的應(yīng)用前景。SchA是從中藥五味子干燥成熟果實提取物中的一種木脂素類化合物，其是五味子的主要有效成分之一［19］，已被證實其在動物模型中有明顯的抗結(jié)腸炎作用［9-12］。本研究結(jié)果也顯示，SchA 在 IBS-D 模型大鼠中具有抗腸炎和保護腸黏膜的作用。

包含IBS-D 在內(nèi)的多種腸道疾病的發(fā)生和發(fā)展中均伴隨著腸粘膜屏障破壞，且腸粘膜屏障功能的缺陷能導(dǎo)致腸道對微生物群的免疫反應(yīng)增強進而加劇腸道炎癥反應(yīng)［7-8］。因此，恢復(fù)腸屏障功能被認為是治療IBS-D 的一種潛在的治療策略［20］。腸屏障功能主要取決于腸道上皮屏障結(jié)構(gòu)的完整性。其中，腸道上皮細胞活性以及腸上皮細胞間緊密連接蛋白的緊密表達分布是維持腸道物理屏障的關(guān)鍵因素［6］。眾多研究已經(jīng)證實，降低腸道黏膜上皮細胞的凋亡，改善腸上皮結(jié)構(gòu)以及增加緊密連接蛋白的表達并改善分布能減輕多種炎性腸?。?1-23］。為探討SchA 對IBS-D 模型大鼠的腸屏障功能的影響，本研究進而觀察了SchA 對腸道黏膜結(jié)構(gòu)、腸道黏膜上皮細胞凋亡以及腸道黏膜中緊密連接蛋白（包括occludin 和 ZO-1）表達的影響，與預(yù)期一致，SchA 能改善IBS-D 模型大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)，降低腸黏膜細胞凋亡并增加腸道黏膜中occludin 和ZO-1 表達，這些結(jié)果證實了SchA 對IBS-D 模型大鼠的腸黏膜屏障具有保護作用。

Figure 4. SchA reduced intestinal inflammation in IBS-D rats. A：CD68 and CD11b（markers of macrophages and neutrophils，respectively）staining images of colon mucosa tissues（scale bar=50 μm）；B：the levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in colon tissues. Mean±SD. n=10.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs model group.圖4 SchA減輕IBS-D大鼠腸炎

在證明其療效后，本研究進一步探討了SchA 在IBS-D 模型大鼠中發(fā)揮腸黏膜屏障保護作用的潛在機制。腸道炎癥反應(yīng)的過度激活被認為是發(fā)生IBSD 的主要原因之一。另外，腸道炎癥反應(yīng)的過度激活也能導(dǎo)致腸粘膜屏障功能的破壞［7-8］。NLRP3炎癥小體可通過caspase-1 和ASC 激活調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)，其中調(diào)節(jié)IBS腸道炎癥反應(yīng)和腸粘膜屏障功能中起著關(guān)鍵作用。已有研究表明，在多種類型的腸損傷動物模型中，降低腸道NLRP3 炎癥小體通路活性能降低腸道炎癥和恢復(fù)腸粘膜屏障功能［24-25］。且已有研究顯示，SchA 對NLRP3 炎癥小體活性具有明顯的抑制作用［26］。本研究在IBS-D 模型大鼠中也證實了SchA 可抑制腸道NLRP3炎癥小體信號通路，提示SchA 在IBS-D 模型大鼠中發(fā)揮抗腸炎和維持腸粘膜屏障功能的作用至少部分與其抑制NLRP3炎癥小體信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，SchA 在IBS-D 模型大鼠中具有抗腸炎和減輕腸粘膜屏障障礙的作用，且其作用在一定程度上與其抑制NLRP3炎癥小體信號通路有關(guān)。

Figure 5. Effect of SchA on NLRP3 inflammasome pathway. Western blot was used to detect NLRP3，ASC and caspase-1 expression levels in colon tissues. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs model group.圖5 SchA對NLRP3炎癥小體通路的影響