TRPV4在心肌細胞缺氧損傷中的作用及機制研究*

陳 卓， 秦 昆， 何玥穎， 魏 朋， 謝高倩， 苗路偉， 陳克明△

（1解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院基礎醫(yī)學實驗室，甘肅 蘭州 730050；2蘭州理工大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730050）

瞬時受體電位陽離子通道V 亞家族成員4（transient receptor potential cation channel subfamily V member 4，TRPV4）是瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道蛋白家族中類香草素亞家族的成員之一［1］。TRP 家族有近 30 個亞型，TRPV4 作為TRP 家族一種非選擇性的陽離子通道而在多種細胞內(nèi)的生理過程中發(fā)揮作用［2］?，F(xiàn)已有研究證明，TRPV4在滲透壓變化、熱、細胞腫脹和化學刺激等過程被激活而發(fā)揮作用［3-6］。

高原缺氧后心肌細胞的氧化應激系統(tǒng)被激活，導致細胞產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），最終引起急性心肌梗死［7］。目前的研究認為Ca2+與ROS 的產(chǎn)生有關。已經(jīng)有研究證明在心臟缺血再灌注損傷中TRPV4 蛋白水平大量升高，并引起心臟收縮增強［8］。此外，Ca2+過度升高與 ROS 大量產(chǎn)生在急性呼吸窘迫綜合征中也起著至關重要的作用［9］。還有研究證明，TRPV4 誘導神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞損傷是通過Ca2+超載和氧化應激［10］。

本實驗將通過使用TRPV4 抑制劑HC-067047，探究缺氧后心肌細胞中TRPV4 的作用機制，及其是如何調(diào)控氧化應激。

材料和方法

1 儀器

MIC-101 型低氧處理盒（Billups-Rothenberg）；IX71 型倒置熒光顯微鏡（Olympus）；EPOCH 型酶標儀（BioTek）；Labofuge 400R 型離心機（Heraeus）；165-8033 型電泳儀（Bio-Rad）；高分辨率活細胞成像（Cytiva）；RT-PCR儀（ViiATM7）；細胞培養(yǎng)箱（Themo）

2 細胞來源

H9C2細胞購于ATCC。

3 試劑

胎牛血清購自 Biological Industries；DMEM 培養(yǎng)基和胰蛋白酶均購于Gibco；CCK-8 試劑購于北京酷來博科技有限公司；ROS 試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；線粒體膜電位試劑盒（JC-1）購于碧云天公司；RIPA 高效裂解液、非變性裂解液、ECL 發(fā)光液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒和Fluo-4 AM試劑盒均購于Solarbio；兔抗TRPV4抗體、兔抗βactin 抗體及山羊抗兔IgG Ⅱ抗均購于Abcam；SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit 和Evo M-MLV RT Kit with gRNA Clean for qPCR 均購于 Accurate Biology。

4 實驗方法

4.1 細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，在含5% CO2的37℃飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，每3 d更換培養(yǎng)基，細胞密度約80%時傳代培養(yǎng)。

4.2 細胞的缺氧處理 將低氧處理盒置于培養(yǎng)箱內(nèi)，取H9C2 細胞換成含1%的胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基后放入低氧盒，打開氣體閥門向盒內(nèi)通入95%N2和5% CO2，檢測氧氣濃度到達1%時，關閉閥門，密封處理盒，并開始計算缺氧時間。倒序0 h、12 h、24 h 和36 h 分別放入H9C2 細胞，待缺氧時間完成后一起取出細胞進行下一步檢測。

4.3 細胞HC-067047 處理 待細胞長至80%，缺氧處理前 2 h 加入 1 μmol/L 的 HC-067047，對照組加入同等含量的DMSO。

4.4 CAT、SOD 和 LDH 活性及 MDA 含量的測定將H9C2細胞種植于60 mm 培養(yǎng)皿中，待長至80%進行缺氧處理。缺氧處理后H9C2 細胞使用非變性裂解液裂解后，15 000 r/min 離心25 min，吸取上清，使用BCA 試劑盒檢測蛋白濃度，再根據(jù)CAT、SOD、MDA 和 LDH 試劑盒說明書檢測 CAT、SOD 和 LDH 活性及MDA 含量，并使用酶標儀在不同的波長下進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

4.5 CCK-8 法檢測細胞活力 首先按照每孔3 000個細胞種植于96 孔板中，缺氧處理后加入含有10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h 后使用酶標儀檢測，按照說明書計算細胞相對活力。

4.6 細胞內(nèi)ROS 檢測 將H9C2 細胞種植于60 mm培養(yǎng)皿中，待長至80%進行缺氧處理。缺氧處理后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 2 遍后加入2 mL DCFH-DA 工作液。培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出后PBS洗3遍。熒光顯微鏡觀察熒光變化，熒光酶標儀最佳激發(fā)波長485 nm，最佳發(fā)射波長525 nm 檢測ROS 熒光強度，并根據(jù)說明書計算ROS水平。

4.7 Western blot 檢測TRPV4 蛋白水平 將H9C2細胞種植于60 mm 培養(yǎng)皿中，待長至80%進行缺氧處理并提前2 h 加入HC-067047。缺氧處理后棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍，RIPA 裂解液裂解細胞后提取蛋白，15 000 r/min 離心 25 min 后取上清，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液沸水煮10 min 使其變性。SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒配制10%分離膠和5%的濃縮膠分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。使用5%的脫脂奶粉使膜封閉2 h，TRPV4（1∶1 000）和 β-actin（1∶10 000）Ⅰ抗孵育過夜。孵育結(jié)束后使用TBST洗膜每遍10 min，共4次。接著加入Ⅱ抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜4次后曝光，加ECL發(fā)光液掃描條帶并進行分析。

4.8 RT-qPCR 檢測 TRPV4 的 mRNA 表達量 將H9C2 細胞種植于60 mm 培養(yǎng)皿中，待長至80%進行缺氧處理提前2 h 加入HC-067047。缺氧處理后棄去培養(yǎng)基，每皿加入1 mL RNAiso Plus 提取細胞內(nèi)RNA。再使用有機溶劑法提取細胞內(nèi)總RNA，接著使用Evo M-MLV RT Kit with gRNA Clean for qPCR 將其反轉(zhuǎn)錄后，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit進行RT-qPCR操作。并使用β-actin作為內(nèi)參對結(jié)果進行校正，用2-ΔΔCt表示各基因的相對表達水平。引物序物見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Primer sequence for RT-qPCR

4.9 使用Fluo-4 AM檢測Ca2+水平 Fluo-4 AM首先用Pluronic F127 溶液等量溶解。用HBSS 稀釋Fluo-4 AM 溶液，制備4 μmol/L 工作液。將工作液加入H9C2細胞中，37 ℃孵育20 min，然后加入5倍體積含1%胎牛血清的HBSS，再培養(yǎng)40 min。用HEPES 洗滌后，用熒光酶標儀檢測鈣離子濃度。最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為506和526 nm。

4.10 線粒體膜電位試劑盒（JC-1）檢測線粒體膜電位 線粒體膜電位高時產(chǎn)生紅色熒光，線粒體膜電位低時產(chǎn)生綠色熒光。用紅綠熒光的相對比值測定線粒體膜電位。將H9C2 細胞種植于60 mm 培養(yǎng)皿中，待長至80%進行缺氧處理提前2 h 加入HC-067047。缺氧處理后棄去培養(yǎng)基，用PBS 洗滌待染色細胞。加入JC-1 染色液，37 ℃孵育20 min。孵育后用JC-1染色緩沖液洗滌，加入適量DMEM 培養(yǎng)基，用熒光顯微鏡和熒光素微孔板觀察。JC-1 單體的最佳激發(fā)光和發(fā)射光分別為490 和530 nm；JC-1 聚集體的最佳激發(fā)光和發(fā)射光分別為525和590 nm。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。采用SPSS 20.0 進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計差異采用單因素方差分析（one-way AVNOVA）。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 H9C2細胞在缺氧環(huán)境發(fā)生氧化性損傷

與常氧組相比，隨著缺氧時間的延長，H9C2 細胞活力發(fā)生明顯下降（P＜0.01），見圖1A。此外，LDH 溢出率和MDA 含量也隨著缺氧時間增多，并在24 h 達到峰值（P＜0.01），見圖1B、C。同時檢測了ROS，發(fā)現(xiàn)綠色熒光隨著缺氧時間明顯變強，見圖1D。并且H9C2 細胞中細胞內(nèi)抗氧化酶CAT 和SOD的活性顯著提升（P＜0.01），見圖1E、F。在缺氧24 h時H9C2 的氧化應激被激活得最為明顯，因此選擇24 h為后續(xù)實驗時點。

2 H9C2細胞在缺氧環(huán)境發(fā)生鈣超載和線粒體損傷

已有研究證明鈣離子與氧化應激有著密不可分的關系。我們發(fā)現(xiàn)H9C2 細胞缺氧24 h 后綠色熒光明顯增多，鈣離子含量明顯增高，見圖2A。JC-1 檢測線粒體膜電位，缺氧24 h后綠色熒光明顯增多，即線粒體膜電位明顯下降，見圖2B。以上結(jié)果說明H9C2在缺氧環(huán)境發(fā)生鈣超載和線粒體損傷。

3 鈣超載是由TRPV4高表達引起

TRPV4 是非選擇性的鈣離子通道。我們猜想H9C2 細胞中的鈣超載可能與TRPV4 有關。實驗發(fā)現(xiàn)缺氧后TRPV4無論是蛋白水平還是mRNA水平均顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖3A、B。并且使用TRPV4激活劑GSK1016790A 檢測鈣離子水平變化，結(jié)果顯示加入激活劑后的H9C2 細胞缺氧處理后比常氧情況下Ca2+有較大漲幅，見圖3C。

4 抑制TRPV4 對H9C2 細胞缺氧后氧化應激系統(tǒng)的影響

Figure 1. Prolonged hypoxia significantly increased oxidative damage of H9C2 cells. A：cell viability；B：LDH release rate；C：the MDA content；D：ROS fluorescence intensity（scale bar=100 μm）；E：SOD activity；F：CAT activity. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖1 缺氧不同時點對H9C2氧化損傷影響

Figure 2. Calcium overload and mitochondrial damage occurred in H9C2 cells after hypoxia（scale bar=50 μm）. A：green fluorescence represents calcium ion；B：red fluorescence represents JC-1 aggregates，and green fluorescence represents JC-1 monomer.圖2 缺氧24 h后觀察H9C2細胞內(nèi)Ca2+和線粒體膜電位的變化

既然缺氧后TRPV4在蛋白和mRNA 水平均顯著上調(diào)，為了探究TRPV4 在H9C2 缺氧后起的作用，我們使用了TRPV4 抑制劑HC-067047 抑制TRPV4，并從mRNA和蛋白水平證明使用抑制劑后TRPV4被抑制，見圖4A、B。與缺氧24 h 相比，加入抑制劑后無論是熒光照片還是量化結(jié)果ROS 水平均顯著下降，見圖4C；同時抗氧化酶CAT 和SOD 活性也均出現(xiàn)下降趨勢，見圖4D、E。此外，缺氧后細胞相對活力下降到80%，加入抑制劑后細胞活力顯著上升，見圖4F。上述結(jié)果表明，TRPV4在H9C2細胞缺氧時被激活并調(diào)控氧化應激系統(tǒng)。

5 TRPV4 通過調(diào)節(jié)鈣離子起作用并會影響線粒體膜電位

為了進一步證明TRPV4調(diào)控氧化應激是否通過Ca2+，我們檢測了使用TRPV4抑制劑HC-067047后細胞內(nèi)Ca2+和線粒體膜電位的變化。結(jié)果顯示，缺氧后鈣離子含量明顯增高，抑制TRPV4 后鈣離子含量也隨之下降，見圖5A。同時缺氧后線粒體膜電位明顯下降，但是抑制TRPV4后線粒體膜電位出現(xiàn)回升，見圖5B。以上實驗結(jié)果說明缺氧狀態(tài)下，TRPV4 會導致H9C2細胞鈣離子升高并影響線粒體膜電位。

Figure 3. Activation of TRPV4 after hypoxia. A：the protein level of TRPV4；B：the mRNA level of TRPV4；C：calcium ion level after adding TRPV4 activator GSK1016790A（GSK）. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 h group.圖3 缺氧前后TRPV4蛋白和mRNA表達水平的變化及Ca2+水平

Figure 4. The addition of TRPV4 inhibitor HC-067047 significantly inhibited the damage of H9C2 cells after hypoxia. A：the protein level of TRPV4；B：the mRNA level of TRPV4；C：ROS fluorescence intensity（scale bar=100 μm）；D：SOD activity；E：CAT activity；F：cell viability. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs NC group.圖4 加入TRPV4抑制劑對H9C2氧化應激系統(tǒng)的影響

討 論

氧氣是心肌細胞活動不可或缺的物質(zhì)，一旦心肌缺氧，會直接導致心肌細胞有氧活動減弱，代謝活動減弱，使得心臟必須的能量供給不足，直接導致心功能下降［11］。同時代謝廢物不能及時清除也進一步對心肌細胞造成傷害［12］。心肌細胞在缺氧的環(huán)境下會啟動氧化應激，增強抗氧化酶SOD 和CAT 等的活性。SOD 是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的一種抗氧化酶，可催化ROS生成水和過氧化氫；幾乎所有的生物體內(nèi)都含有CAT，它能將過氧化氫催化生成水和氧氣，SOD 和 CAT 共同維持氧化與抗氧化平衡［13］。但是心肌細胞如何感知缺氧尚未解釋清楚。

Figure 5. After the addition of TRPV4 inhibitor HC-067047，intracellular calcium ion level decreased and mitochondrial membrane potential returned to normal. A：calcium ion level；B：mitochondrial membrane potential. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 h group；##P＜0.01 vs NC group.圖5 加入TRPV4抑制劑對Ca2+和線粒體的影響

本實驗首先建立H9C2細胞缺氧模型，發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時間的延長，細胞活力、LDH 釋放率、MDA 含量及ROS 水平等結(jié)果證實氧化損傷逐步加重，并在24 h 達到頂峰；同時抗氧化酶CAT 和SOD 的活性隨著缺氧時間的延長也均顯著提高，并在24 h達到頂峰。值得注意的是，到36 h會出現(xiàn)減弱，這可能是由于氧化與抗氧化是一個動態(tài)平衡的過程，24 h 為整個缺氧過程中的一個重要拐點。因此后續(xù)我們選擇24 h為缺氧時點。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+內(nèi)流會促進ROS 生成，同時線粒體作為細胞內(nèi)產(chǎn)生最多ROS的細胞器也被認為與氧化損傷有關［14］。本實驗結(jié)果證明，H9C2 細胞缺氧24 h 后，細胞內(nèi)Ca2+含量大量增高，同時線粒體膜電位受損，這說明H9C2細胞的氧化應激很有可能與Ca2+有關。TRPV4 是一個Ca2+高滲透性的陽離子通道。在近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在許多細胞（如尿路上皮細胞和巨噬細胞等）中激活TRPV4 會導致Ca2+內(nèi)流，從而促進 ROS 生成［15-16］。我們發(fā)現(xiàn) H9C2 細胞缺氧后TRPV4 的mRNA 和蛋白水平均有所升高，這說明在缺氧過程中TRPV4 被激活。為了探究Ca2+超載是否是由于TRPV4 通道激活導致，我們使用TRPV4 激活劑后Ca2+升高程度明顯增強。上述結(jié)果說明H9C2 缺氧后會激活TRPV4 并導致Ca2+超載和線粒體受損。

為了進一步探究在H9C2 細胞缺氧后TRPV4 的作用機制，我們使用了TRPV4 特異性抑制劑HC-067047。首先我們驗證了加入抑制劑后TRPV4 的mRNA 和蛋白均被抑制。在缺氧環(huán)境下，TRPV4 被激活，ROS 含量明顯增多，CAT 和 SOD 活性也明顯上升，說明細胞受到了氧化損傷，細胞活力降低也證實了這一點。但是當抑制TRPV4 之后，所有的一切都被逆轉(zhuǎn)了，ROS 顯著降低，CAT 和 SOD 活性也顯著下降，細胞活力也明顯上升。這說明在H9C2 細胞中，缺氧會激活TRPV4進而導致氧化應激的產(chǎn)生。

已有研究證明，在血管內(nèi)皮細胞中TRPV4 激活導致鈣離子內(nèi)流是誘發(fā)線粒體ROS增多的重要原因之一［17］。此外，Ca2+超載和過度累積的ROS會導致線粒體膜電位去極化，進而加速細胞死亡［18］。為了進一步確認在H9C2 細胞中TRPV4 的作用機制是否是通過Ca2+和線粒體，我們首先檢測了H9C2 細胞中的Ca2+，結(jié)果顯示缺氧后心肌細胞鈣離子含量明顯升高，這與之前的結(jié)果一致，并且在加入HC-067047 后被顯著抑制。接著使用JC-1 檢測鈣離子膜電位，缺氧24 h后紅綠熒光比例下降，說明H9C2細胞線粒體受損，當抑制TRPV4后，線粒體膜電位恢復正常。

綜上所述，在心肌細胞中，缺氧后TRPV4被激活而引發(fā)鈣離子內(nèi)流，線粒體受損進而導致ROS 大量生成，進一步通過CAT 和SOD 調(diào)控細胞內(nèi)氧化應激系統(tǒng)。本研究為心肌細胞抗缺氧藥物的開發(fā)提供了一個新的靶點。