小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在創(chuàng)傷性腦損傷中的作用機(jī)制研究*

顧艷蘭 ， 趙思遠(yuǎn)， 陸秋霞， 張優(yōu)利， 杜娟娟， 任艷華， 王萬(wàn)鐵， 廖 敏△

（1溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所，浙江 溫州 325035）

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）通常起源于原發(fā)性損傷，與腦部受到的外部打擊直接有關(guān)，隨著體內(nèi)免疫反應(yīng)的進(jìn)行，損傷逐步發(fā)展為繼發(fā)性損傷［1］。TBI 后，能量缺乏和細(xì)胞壞死產(chǎn)物的刺激導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)釋放，引起神經(jīng)細(xì)胞死亡，這些炎癥介質(zhì)進(jìn)一步破壞血腦屏障，導(dǎo)致血液成分進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，更多的炎癥細(xì)胞滲出和浸潤(rùn)，釋放更大量的炎癥因子［2］。原發(fā)性損傷在損傷后即刻發(fā)生，而繼發(fā)性損傷可以進(jìn)行治療干預(yù)因而受到了更多的關(guān)注。其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞——小膠質(zhì)細(xì)胞參與的神經(jīng)炎癥在一系列繼發(fā)性損傷中起到了推進(jìn)作用［3］。TBI 所致的炎癥反應(yīng)始于組織損傷后釋放的損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）。DAMPs 短時(shí)內(nèi)即可與小膠質(zhì)細(xì)胞表面的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）和核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor，NLR）結(jié)合，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞為促炎作用的經(jīng)典激活型（M1 型）和抑炎作用的代替激活型（M2型）的混合表型［4］。其中M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中起到關(guān)鍵作用，因此探索小膠質(zhì)細(xì)胞在TBI 導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷中的異?；罨耙鸬难装Y反應(yīng)對(duì)其治療具有重要意義。

TLR 是一類主要表達(dá)于免疫細(xì)胞上的跨膜受體，在識(shí)別特異性配體后激活免疫炎癥反應(yīng)［5］。TLR主要通過(guò)核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。MAPK 信號(hào)通路的兩個(gè)特異性激酶——絲裂原活化蛋白激酶激酶4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）和MKK7 能使 c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的第183位蘇氨酸（Thr183）和第185位酪氨酸（Tyr185）位點(diǎn)磷酸化，從而激活JNK［6］。

MKK7 是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中MAPK 家族的成員之一，是TLR 信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白酶［6-7］。小泛素樣修飾蛋白特異性蛋白酶3［small ubiquiton-like modifier（SUMO）-specific proteases 3，SENP3］主要定位于核仁，是一種氧化應(yīng)激敏感蛋白，在氧化應(yīng)激下發(fā)生亞細(xì)胞定位和穩(wěn)定性的改變，可在胞質(zhì)中迅速累積，特異性去除底物蛋白上的小泛素樣修飾蛋白2/3（small ubiquitin-like modifier 2/3，SUMO2/3）［8］。體外研究表明，SENP3能夠通過(guò)對(duì)MKK7進(jìn)行去SUMO化來(lái)增強(qiáng)JNK 磷酸化，磷酸化的JNK 激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）的表達(dá)，產(chǎn)生大量促炎因子［9］。目前小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的 SENP3 與 TBI 后炎癥反應(yīng)的關(guān)系尚不明確。

BV-2 細(xì)胞系為 Blasi 等［10］在 1990 年應(yīng)用攜帶癌基因v-raf/v-myc的反轉(zhuǎn)錄病毒J2 感染原代培養(yǎng)的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞而獲得的永生細(xì)胞系，該細(xì)胞系不僅高度純化，而且基本具備了原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、表型以及各項(xiàng)功能特點(diǎn)。我們?cè)诖思?xì)胞系上建立機(jī)械性損傷模型，模擬TBI。此模型操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好且重復(fù)性高［11］，是公認(rèn)的體外TBI 研究模型。本研究擬利用此模型以研究小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的SENP3在TBI后的作用及其部分機(jī)制。

材料和方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)

BV-2 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)室原有。使用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)液，在5% CO2培養(yǎng)箱中維持37 ℃培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化，按1∶4傳代。

2 主要試劑

DMEM/F12 培養(yǎng)液、胰蛋白酶及胎牛血清購(gòu)自HyClone；RIPA 裂解液和 CCK-8 試劑盒購(gòu)于 Beyotime；山羊源離子鈣結(jié)合銜接分子1（ionized calciumbinding adapter molecule 1，Iba1）多克隆抗體購(gòu)于Novus；兔源TLR4 單抗、兔源誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）單抗、兔源SENP3 單抗、兔源 p-JNK 單抗及兔源 SUMO2/3 單抗均購(gòu)于Cell Signaling Technology；兔源白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和 IL-6 抗體均購(gòu)于 Abcam；DyLight 594標(biāo)記驢抗兔熒光Ⅱ抗和DyLight 488標(biāo)記驢抗羊熒光Ⅱ抗購(gòu)于Jackson ImmunoResearch；內(nèi)參照鼠抗β-actin 多克隆抗體購(gòu)于Abgent；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；所用引物由上海生工生物工程有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1. The sequences of the primers used in RT-PCR

3 主要方法

3.1 體外TBI模型的構(gòu)建 以1 000 μL的微量移液器塑料吸頭于6 孔板內(nèi)劃割，造成BV-2 膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷，輕度損傷（light）組橫豎各劃兩道，重度損傷（heavy）組橫豎各劃三道（圖1）。依據(jù)事先在培養(yǎng)板底面畫好的標(biāo)記線劃割培養(yǎng)的細(xì)胞，標(biāo)記線均勻分布在培養(yǎng)皿底面，保證同一組內(nèi)的細(xì)胞損傷范圍與程度一致。

Figure 1. Schematic diagram of constructing an in vitro traumatic brain injury model.圖1 構(gòu)建體外創(chuàng)傷性腦損傷模型的示意圖

3.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞活力 細(xì)胞處理結(jié)束后，根據(jù)說(shuō)明書每孔加入100 μL的CCK-8混合液（VCCK-8∶VDMEM培養(yǎng)液=1∶10），放入常氧培養(yǎng)箱孵育0.5 h～2 h，置酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)量吸光度（A）值。

3.3 細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）濃度的測(cè)定 將細(xì)胞在H2O2測(cè)定試劑盒提供的200 μL裂解緩沖液中裂解，12 000×g離心10 min 收集上清液，用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度。將樣品溶液（50 μL）與反應(yīng)溶液（100 μL）在室溫下孵育30 min，然后測(cè)量560 nm 處的吸光度（A）。H2O2濃度由標(biāo)準(zhǔn)溶液制成標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

3.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取各組細(xì)胞蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。采用SDS-PAGE 分離蛋白，半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉 2 h，加入抗TLR4、SENP3、MKK7、p-JNK、SUMO2/3、IL-1β、TNF-α、IL-6、iNOS、精氨酸酶1（argi-nase 1，ARG1）和β-actin 抗體，稀釋度均為1∶1 000，4 ℃過(guò)夜，TBST 清洗后加Ⅱ抗37 ℃孵育2 h，清洗后ECL 化學(xué)發(fā)光及顯影。采用ImageJ 軟件分析目的條帶。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取3次的均值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.5 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色 各組細(xì)胞爬片經(jīng)丙酮固定，0.5% Triton X-100 破膜，血清封閉，加入Ⅰ抗［兔抗SENP3（1∶400）和兔抗Iba1（1∶1 000）］，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS 清洗，加熒光Ⅱ抗（1∶1 000），37 ℃孵育1 h。PBS 清洗，DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，室溫孵育3 min。PBS 清洗，抗熒光淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡在10×10倍下攝片。

3.6 RT-PCR Trizol 法提細(xì)胞總RNA：每孔細(xì)胞加1 mL Trizol，用加樣槍吹至液體澄清且無(wú)細(xì)胞團(tuán)，吸取至1.5 mL EP 管，顛倒混勻后室溫靜置5 min；每管加氯仿200 μL，顛倒混勻后室溫靜置5 min；4 ℃、12 000×g離心 15 min；轉(zhuǎn)上層水相 400 μL 于另一1.5 mL EP 管中，加等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置 10 min；4 ℃、12 000×g離心 10 min；棄上清，加預(yù)冷DEPC 水配制的75%乙醇200 μL，4 ℃、12 000×g離心 5 min；棄上清，空氣干燥 5～10 min 后，每管加30 μL DEPC 水溶解，立即用于逆轉(zhuǎn)錄或分裝-80 ℃保存。提取RNA，濃度定量后，據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書進(jìn)行20 μL 體系反轉(zhuǎn)錄及 25 μL 體系 RT-PCR，待反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行mRNA相對(duì)表達(dá)水平的分析。

3.7 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染前1 d 以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于 6 孔板；取 5 μL 20 μmol/L 的 siRNA 加入無(wú)血清抗生素的培養(yǎng)基中，定容至100 μL，再加入 5 μL 轉(zhuǎn)染試劑，吹打混勻后室溫靜置10～15 min；將100 μL 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入含有2 mL 培養(yǎng)液的細(xì)胞中，搖晃混勻，于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱孵育6～18 h 后換液，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。siRNA序列如下：

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（meas±SD）表示。各組間采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。

結(jié) 果

1 TBI 后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3 表達(dá)上調(diào)并伴隨TLR4信號(hào)通路的激活

損傷后6 h 細(xì)胞活力開始下降，在12 h 降到最低，并且至24 h 回升，見圖2A；細(xì)胞內(nèi)H2O2濃度在損傷后12 h降到最低，至24 h回升，見圖2B。這提示損傷后氧化應(yīng)激的程度在損傷后12 h 最高，我們推測(cè)SENP3 在細(xì)胞中積累程度也最高，因此本次研究選取損傷后12 h 作為觀察時(shí)點(diǎn)。隨著損傷程度的加重，SENP3、p-JNK 和 SUMO2/3 的蛋白水平逐漸升高（P＜0.05 或P＜0.01），MKK7 在重度損傷 12 h 后顯著升高（P＜0.01），但輕度損傷組與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，見圖2C。隨著時(shí)間的推移（重度損傷模型建立6 和 18 h 后），SENP3 蛋白表達(dá)水平及 JNK 磷酸化水平逐漸升高（P＜0.05 或P＜0.01），TLR4 在損傷后表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），但在損傷6 h和18 h組間無(wú)顯著差異，見圖3。

2 TBI后SENP3促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化

以Iba1 作為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，免疫熒光染色結(jié)果顯示，重度損傷組中的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3表達(dá)水平顯著高于其他兩組（P＜0.01），見圖2D。分別以iNOS和ARG1為M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，Western blot 結(jié)果顯示，在重度損傷模型建立后6和18 h（對(duì)照組不作處理），iNOS 和TNF-α 的蛋白相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05 或P＜0.01）；IL-1β 在重度損傷后顯著升高（P＜0.05），且在損傷6 和18 h后無(wú)顯著差異；IL-6 在損傷后6 h 無(wú)顯著變化（P＞0.05），在 18 h 顯著下降（P＜0.01）；ARG1 蛋白表達(dá)水平在6 h 時(shí)顯著下降（P＜0.01），且18 h 與6 h 相比無(wú)顯著差異，見圖4A。同時(shí)，RT-PCR 結(jié)果顯示，NOS2的mRNA 水平在損傷后顯著升高（P＜0.05），但在損傷 6 h 和 18 h 后無(wú)顯著差異；TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的mRNA 水平隨時(shí)間推移而逐漸升高（P＜0.05 或P＜0.01），見圖4B。

3 SENP3 下調(diào)顯著降低TLR 信號(hào)通路的激活及相關(guān)炎癥因子的釋放

我們利用siRNA 特異性敲減SENP3后，Western blot 結(jié)果顯示，SENP3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），TLR4 信號(hào)通路上的 MKK7 蛋白表達(dá)水平略有下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），JNK 的磷酸化水平顯著降低（P＜0.01），同時(shí)IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），見圖5。

Figure 2. The elevation of SENP3 in microglia after traumatic brain injury was positively correlated with the activation of TLR4 signaling pathway. A and B：the BV-2 cells were heavily damaged for 0，6，12，18 and 24 h，and the cell viability and the level of H2O2 were detected by CCK-8 assay and H2O2 assay，respectively；C：the BV-2 cells were damaged at different degrees（light and heavy）for 12 h，and the protein levels of SENP3，MKK7，p-JNK and SUMO2/3 in the BV-2 cells were detected by Western blot；D：the BV-2 cells were damaged at different degrees（light and heavy）for 12 h，and the effect of traumatic brain injury on the expression of SENP3 in the BV-2 cells was detected by immunofluorescence staining. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 h group；##P＜0.01 vs 18 h group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs control group；▲▲P＜0.01 vs light group.圖2 創(chuàng)傷性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3的上調(diào)伴隨著TLR4信號(hào)通路的激活

Figure 3. The elevation of SENP3 in microglia after traumatic brain injury promoted the activation of TLR4 signaling pathway. BV-2 cells were heavily damaged for 0，6 and 18 h，and the protein levels of TLR4，SENP3，p-JNK and MKK7 at 6 h and 18 h after injury were detected by Western blot. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，##P＜0.01 vs 6 h group.圖3 創(chuàng)傷性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3的上調(diào)促進(jìn)TLR4信號(hào)通路的激活

討 論

TBI 是頭部遭受外力打擊導(dǎo)致的一種嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，已成為全球范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題［1］。抑制免疫反應(yīng)導(dǎo)致的繼發(fā)性損傷是改善TBI 預(yù)后的有效方法。本研究利用小膠質(zhì)細(xì)胞建立體外劃痕損傷模型，模擬TBI，揭示SENP3 或?yàn)門BI后神經(jīng)炎癥的重要參與者。

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中主要的常駐免疫細(xì)胞，被認(rèn)為是TBI后神經(jīng)炎癥的關(guān)鍵參與者［12］。

已有研究表明，在巨噬細(xì)胞中的SENP3 能夠通過(guò)對(duì)MKK7去SUMO化來(lái)增強(qiáng)JNK的磷酸化，從而激活A(yù)P-1 表達(dá)，產(chǎn)生大量的促炎因子［11］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨著損傷程度的加重及損傷后時(shí)間的推移，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3蛋白表達(dá)持續(xù)上升，并伴隨著TLR4 信號(hào)通路的激活。這一結(jié)果提示SENP3 能夠通過(guò)對(duì)MKK7 進(jìn)行去SUMO 化，增強(qiáng)JNK 的磷酸化，促進(jìn)TLR4 信號(hào)通路的激活，最終促進(jìn)炎癥因子的釋放。

活化的M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞的特征是釋放促炎因子，可進(jìn)一步加劇組織炎癥和損傷，是影響TBI 預(yù)后的關(guān)鍵因素［13］。本研究表明SENP3表達(dá)的上升能夠促使損傷后的小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型分化，并且分泌大量的炎癥因子，促進(jìn)腦部炎癥的發(fā)生與發(fā)展。最后我們用siRNA 敲減SENP3，使得小膠質(zhì)細(xì)胞中MKK7的表達(dá)略有下降，JNK 的磷酸化受到抑制，并且使炎癥因子的表達(dá)顯著降低，驗(yàn)證了SENP3對(duì)于TLR4信號(hào)通路以及小膠質(zhì)細(xì)胞極化的促進(jìn)作用。

Figure 4. SENP3 promoted M1 type polarization of microglia after traumatic brain injury. The BV-2 cells were heavily damaged for 0，6 and 18 h. A：the protein levels of iNOS，ARG1，IL-1β，TNF-α and IL-6 at 6 h and 18 h after injury were detected by Western blot；B：the mRNA expression of NOS2，TNF-α，IL-1β and IL-6 was determined by RT-PCR. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 6 h group.圖4 創(chuàng)傷性腦損傷后SENP3促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化

Figure 5. Knockdown of SENP3 significantly reduced the activation of TLR4 signaling pathway and the release of related inflammatory factors. The protein levels of SENP3，p-JNK，MKK7，IL-1β and TNF-α in BV-2 cells were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-Con group.圖5 敲減SENP3顯著降低TLR信號(hào)通路的激活及相關(guān)炎癥因子的釋放

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)SENP3 表達(dá)水平升高，TLR4 信號(hào)通路被激活，并伴隨小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型極化，釋放大量炎癥因子；利用siRNA 敲減SENP3的結(jié)果表明，降低SENP3 表達(dá)水平抑制了TBI 導(dǎo)致的TLR4 信號(hào)通路激活及小膠質(zhì)細(xì)胞向M1 型的極化。這些結(jié)果提示SENP3 可能在TBI后繼發(fā)性損傷中發(fā)揮了重要作用。